禽病源性大肠杆菌E058株neuC基因突变株的构建及致病性

徐亚亚+纪康+卢劲晔+蒋珊珊+郝福星

摘要：运用Red重组系统构建E058ΔneuC基因缺失突变株。细菌生长曲线结果，突变株E058ΔneuC比野生株E058的生长速度稍慢。在血清杀菌试验中，与野生株E058相比，E058ΔneuC在血清中的存活率显著下降。体外竞争结果表明，突变株E058ΔneuC毒力被轻度的致弱。体内动态分布试验中，E058ΔneuC突变株在受检脏器中的细菌数较APECE058株均明显下降，在心、肝、脾、肾中极显著下降，在肺中也极显著下降。结果表明，neuC基因与APECE058株的致病性有较强关联性。

关键词：禽病源性大肠杆菌；neuC基因；突变株；致病性

中图分类号：S852.61+2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0234-03

禽大肠杆菌病由禽源性大肠杆菌引起，造成局部或全身性感染，包括大肠杆菌性蜂窝织炎（炎性过程）、Hjarre氏病（肉芽肿）、败血症、气囊病、腹膜炎、滑膜炎/骨髓炎、脐炎/卵黄囊感染、肿头综合征、输卵管炎、全眼球炎等，大肠杆菌病对养禽业造成严重的经济损失，在禽病调查中疾病是胴体报废的主要原因，禽肉加工中43%肉鸡胴体的报废与大肠杆菌病有关[1-2]。禽病原性大肠杆菌致病相关的毒力因子已相继报道，如Ι型菌毛、P菌毛、荚膜、脂多糖复合物、铁摄取系统（气杆菌素、铁系统和耶尔森氏菌强毒力岛等）[3-4]、空泡形成毒素（vacuolatingautotransportertoxin，VAT）[5-6]、侵袭素IbeA[7]等。[LL]禽大肠杆菌病不仅有复杂的致病机理，而且部分的毒力因子功能还有待进一步明确。

本研究从我国分离的禽病原性大肠杆菌E058株（O2血清型）在芯片杂交试验中获得的表达差异片段中选取neuC基因片段为研究对象[8]，构建E058ΔneuC突变株，通过动物试验，探讨基因neuC和E058株致病性之间的关系。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒菌株和质粒见表1。

1.1.3主要试剂

TaqDNAPolymerase、T4连接酶、DNaseⅠ购自Fermentas公司；dNTP、DNA限制性内切酶、DNAmarker购自大连TaKaRa公司；PCRcleanupkit、AgaroseGelDNAPurificationKit购自杭州AXYGEN公司；SDS、NaAc、EDTA、ATP、Casaminoacids，2′，2′-dipyridyl购自Sigma公司；L-阿拉伯糖购自BioBasic公司；Tryptone、Yeastextract为Oxoid产品；其他试剂均为国产分析纯级产品；抗生素使用浓度为：氨苄青霉素60μg/mL、卡那霉素50μg/mL。

1.1.4试验鸡

SPF鸡由北京梅里亚维通试验动物技术有限公司提供，SPF种蛋本室自行孵化。

1.2方法

1.2.1分子生物学及数据分析软件

PrimerPremier5.0引物设计软件；Lasergene序列分析软件；GraphPadPrism5数据分析软件。

1.2.2T-neuC-Kan重组质粒的构建

以E058野生株基因组DNA为模板，采用普通PCR扩增neuC基因。应用neuC-F/neuC-R引物，用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行PCR鉴定。PCR产物经鉴定是预期大小的片段，然后用AgaroseGelDNA胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。将纯化回收的neuC基因片段直接克隆入pMD·18-T载体中。采用CaCl2法按《分子克隆》所述步骤进行将连接产物进行转化，涂板，完成感受态细胞的制备，参照《分子克隆》相关步骤[9-10]进行菌落挑取，进行培养，以及提取小量的质粒；提取质粒后再进行BamHⅠ-HindⅢ双酶切的鉴定，鉴定正确即为重组质粒T-neuC。设计1对引物，上游引物T-neuC-F的5′端引入EcoRⅠ位点；下游引物T-neuC-R的5′端引入EcoRⅠ位点。上、下游引物扩增片段约为3.2kb。以重组质粒T-neuC为模板，反向PCR扩增T-neuC片段。将纯化回收反向扩增的T-neuC片段和pUC4K质粒分别用EcoRⅠ酶切。将回收的反拉T-neuC片段与酶切下来的Kan片段连接。将连接产物涂板，再挑取菌落、培养和质粒的小量提取等，质粒提取后分别用EcoRⅠ酶切鉴定，电泳鉴定，正确的质粒委托专业检测公司完成测序验证，测序鉴定正确的即为重组质粒T-neuC-Kan。

1.2.2电转化亲本株E058构建突变株E058ΔneuC

将PCR扩增的T-neuC-Kan片段电转化到含有感受态细胞的E058中，通过Red重组系统构建突变株E058ΔneuC。

1.3细菌生长曲线测定

将野生株E058和突变株E058ΔneuC在LB基础培养基中过夜培养，加入10mL的LB液体培养基中（调节D600nm=0.05）。以220r/min条件在37℃恒温摇床中摇振培养；连续4h，每隔30min测定细菌的D600nm，绘制野生株和突变株的生长曲线，并对野生株与突变株的生长速度进行观察。

1.4SPF鸡血清的杀菌性试验

采集SPF鸡血清并充分混匀，储存于-70℃备用。将混匀的血清用pH值7.2的PBS缓冲液稀释为0.5%、2.5%、5%、12.5%、25%的血清悬液，以及1份25%的灭能血清（56℃金属浴30min灭能）。取10μL菌液（含有106CFU的细菌）分别加到190μL血清悬液以及灭能血清中，37℃培养30min。取出，在普通LB平板上进行细菌挂板计数，18h后观察细菌生长数量。

1.5体外竞争试验

将细菌的浓度调至1×108CFU/mL，E058野生株与E058ΔneuC突变株各自以1∶1的比例混合均匀，接种于LB培养基中，37℃静置培养4h。然后分别用无抗性的LB平板和含有kanamycin抗性的LB平板对细菌计数，18h后可以观察到结果。竞争指数（CI）的公式计算方法是：输出量的比率（突变株/野生株）除以输入量的比率（突变株/野生株）。若CI值在0.1～1.0之间，表明突变株毒力被轻度致弱；如CI值在0.01～0.10之间，表明突变株毒力被中度致弱；若如CI值在0～0.01之间表明突变株毒力被高度致弱[11]。endprint

1.6体内动态分布试验

将细菌浓度调至1×108CFU/mL，45羽35日龄的SPF鸡，随机分为3组，每组15羽，其中2组分别于左胸的气囊接种0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突变株，还有1组为空白对照。接种24h后，全部扑杀，取心血及肝、脾、肺、肾，称重后研磨，经过稀释后用无抗性的LB固体培养基、kanamycin抗性培养基进行细菌计数，18h后观察结果。

2结果与分析

2.1突变株E058ΔneuC的鉴定

突变株E058ΔneuC经引物neuC-F/neuC-R扩增出1700bp的条带，而亲本株E058扩增出900bp的条带。与预期的结果相一致。

2.2生长曲线

从生长曲线上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生长速度稍慢（图1）。

2.3血清杀菌

在血清杀菌试验中，血清浓度从低到高分别为0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的灭活血清。从图2可以看出血清浓度为5%、12.50%、25%时突变株E058ΔneuC被轻度致弱。

2.4体外竞争

对E058、E058ΔneuC株分别细菌计数至1×108CFU，分别将等量的E058ΔneuC与E058混合于2mLLB培养基中，37℃培养4h。在有、无抗性的LB平板上，根据其计数结果，计算得到E058ΔneuC和E058的CI值为0.65。结果表明，在体外突变株E058ΔneuC毒力被轻度致弱。

2.5体内动态分布

体内动态分布结果，与E058相比，突变株E058ΔneuC的毒力极显著被致弱（图3）。接种24h后，亲本株E058在心脏细菌检出数量为1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、肾中的细菌检出数量为1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突变株在心脏、肝、脾、肺、肾中的细菌检出数量为1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，两者差异达极显著水平。

3结论

禽大肠杆菌作为家禽最常见的病原菌之一，给养禽业造成严重的经济损失。虽然禽大肠杆菌和致病力相关的毒力因子已经相继报道。然而许多毒力因子是通过一系列的感染模型被证明。在自然条件下，大肠杆菌感染动物的发病机理尚未完全清楚，已知致病因子仅能用于解释感染过程中间环节的某些步骤。

NeuC基因与荚膜形成有关，而荚膜是大肠杆菌中重要的毒力因子之一[12]。荚膜有3个区域，其中区域1、区域3主要负责将细菌胞内的高分子聚合物转运到胞外，区域2跟荚膜的形成、激活、聚合等相关联。而neuC基因在区域2中，荚膜能保护菌体免受宿主免疫机制的侵害以及降低巨噬细胞对细菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重组系统构建的E058ΔneuC突变株开展了多项相关动物试验，评价了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的关系。从生长曲线来看，E058ΔneuC突变株的生长速度稍慢。不同浓度的SPF鸡血清中的E058ΔneuC突变株的存活能力有所下降，特别是浓度从5%～25%的鸡血清中，与亲本株比较达到显著的差异水平；体外竞争试验中突变株的CI值都在0.1～1.0之间，突变株轻度致弱；体内动态分布试验结果，E058ΔneuC突变株在受检脏器内的细菌较APECE058株均有不同程度的下降，表明突变株定植于各受检脏器的能力减弱，进而说明突变株的毒力减弱。

综上所述，NeuC基因与APECE058株致病性有较强的关系，并与芯片杂交结果相一致。

参考文献：

[1]CalnekWB.禽病学[M].10版.高福，苏敬良，译.北京：中国农业出版社，1999.

[2]甘孟侯.中国禽病学[M].北京：中国农业出版社，1999.

[3]HarryEG，ChubbLG.RelationshipsbetweencertainbiochemicalcharacteristicsandpathologicalactivityinavianstrainsofE.coli[J].JournalofComparativePathology，1964，74：180-187.

[4]LloydAL，RaskoDA，MobleyHL.Defininggenomicislandsanduropathogen-specificgenesinuropathogenicEscherichiacoli[J].JournalofBacteriology，2007，189（9）：3532-3546.

[5]Dho-MoulinM，vandenBoschJF，GirardeauJP，etal.SurfaceantigensfromEscherichiacoliO2andO78strainsofavianorigin[J].InfectionandImmunity，1990，58（3）：740-745.

[6]NavehMW，ZusmanT，SkutelskyE，etal.AdherencepiliinavianstrainsofEscherichiacoli：effectonpathogenicity[J].AvianDiseases，1984，28（3）：651-661.

[7]WhittamTS，WilsonRA.GeneticrelationshipsamongpathogenicstrainsofavianEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，1988，56（9）：2458-2466.

[8]宦海霞，周琼，赵李祥，等.应用DNA芯片技术研究体外表达禽致病性大肠杆菌可能致病基因[J].微生物学报，2008，48（1）：103-111.

[9]GaoS，LiuXF，ZhangRK，etal.TheisolationandidentificationofpathogenicEscherichiacoliisolatesofchickenoriginfromsomeregionsinChina[J].ActaVeterinariaetZootechnicalSinica，1999，30：164-171.

[10]LiG，LaturnusC，EwersC，etal.IdentificationofgenesrequiredforavianEscherichiacolisepticemiabysignaturetaggedmutagenesis[J].InfectionandImmunity，2005，73：2818-2827.

[11]RussoTA，McFaddenCD，Carlino-MacDonaldUB，etal.IroNfunctionsasasiderophorereceptorandisaurovirulencefactorinanextraintestinalpathogenicisolateofEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，2002，70：7156-7160.

[12]KaijserB，HansonLA，JodalV，etal.FrequencyofE.coliKantigensinurinary-tractinfectionsinchildren[J].Lancet，1977，1：664-666.

[13]RobertsIS.Bacterialpolysaccharidesinsicknessandinhealth[J].Microbiology，1995，141（9）：2023-2031.endprint

1.6体内动态分布试验

将细菌浓度调至1×108CFU/mL，45羽35日龄的SPF鸡，随机分为3组，每组15羽，其中2组分别于左胸的气囊接种0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突变株，还有1组为空白对照。接种24h后，全部扑杀，取心血及肝、脾、肺、肾，称重后研磨，经过稀释后用无抗性的LB固体培养基、kanamycin抗性培养基进行细菌计数，18h后观察结果。

2结果与分析

2.1突变株E058ΔneuC的鉴定

突变株E058ΔneuC经引物neuC-F/neuC-R扩增出1700bp的条带，而亲本株E058扩增出900bp的条带。与预期的结果相一致。

2.2生长曲线

从生长曲线上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生长速度稍慢（图1）。

2.3血清杀菌

在血清杀菌试验中，血清浓度从低到高分别为0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的灭活血清。从图2可以看出血清浓度为5%、12.50%、25%时突变株E058ΔneuC被轻度致弱。

2.4体外竞争

对E058、E058ΔneuC株分别细菌计数至1×108CFU，分别将等量的E058ΔneuC与E058混合于2mLLB培养基中，37℃培养4h。在有、无抗性的LB平板上，根据其计数结果，计算得到E058ΔneuC和E058的CI值为0.65。结果表明，在体外突变株E058ΔneuC毒力被轻度致弱。

2.5体内动态分布

体内动态分布结果，与E058相比，突变株E058ΔneuC的毒力极显著被致弱（图3）。接种24h后，亲本株E058在心脏细菌检出数量为1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、肾中的细菌检出数量为1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突变株在心脏、肝、脾、肺、肾中的细菌检出数量为1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，两者差异达极显著水平。

3结论

禽大肠杆菌作为家禽最常见的病原菌之一，给养禽业造成严重的经济损失。虽然禽大肠杆菌和致病力相关的毒力因子已经相继报道。然而许多毒力因子是通过一系列的感染模型被证明。在自然条件下，大肠杆菌感染动物的发病机理尚未完全清楚，已知致病因子仅能用于解释感染过程中间环节的某些步骤。

NeuC基因与荚膜形成有关，而荚膜是大肠杆菌中重要的毒力因子之一[12]。荚膜有3个区域，其中区域1、区域3主要负责将细菌胞内的高分子聚合物转运到胞外，区域2跟荚膜的形成、激活、聚合等相关联。而neuC基因在区域2中，荚膜能保护菌体免受宿主免疫机制的侵害以及降低巨噬细胞对细菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重组系统构建的E058ΔneuC突变株开展了多项相关动物试验，评价了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的关系。从生长曲线来看，E058ΔneuC突变株的生长速度稍慢。不同浓度的SPF鸡血清中的E058ΔneuC突变株的存活能力有所下降，特别是浓度从5%～25%的鸡血清中，与亲本株比较达到显著的差异水平；体外竞争试验中突变株的CI值都在0.1～1.0之间，突变株轻度致弱；体内动态分布试验结果，E058ΔneuC突变株在受检脏器内的细菌较APECE058株均有不同程度的下降，表明突变株定植于各受检脏器的能力减弱，进而说明突变株的毒力减弱。

综上所述，NeuC基因与APECE058株致病性有较强的关系，并与芯片杂交结果相一致。

参考文献：

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[5]Dho-MoulinM，vandenBoschJF，GirardeauJP，etal.SurfaceantigensfromEscherichiacoliO2andO78strainsofavianorigin[J].InfectionandImmunity，1990，58（3）：740-745.

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[7]WhittamTS，WilsonRA.GeneticrelationshipsamongpathogenicstrainsofavianEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，1988，56（9）：2458-2466.

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[9]GaoS，LiuXF，ZhangRK，etal.TheisolationandidentificationofpathogenicEscherichiacoliisolatesofchickenoriginfromsomeregionsinChina[J].ActaVeterinariaetZootechnicalSinica，1999，30：164-171.

[10]LiG，LaturnusC，EwersC，etal.IdentificationofgenesrequiredforavianEscherichiacolisepticemiabysignaturetaggedmutagenesis[J].InfectionandImmunity，2005，73：2818-2827.

[11]RussoTA，McFaddenCD，Carlino-MacDonaldUB，etal.IroNfunctionsasasiderophorereceptorandisaurovirulencefactorinanextraintestinalpathogenicisolateofEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，2002，70：7156-7160.

[12]KaijserB，HansonLA，JodalV，etal.FrequencyofE.coliKantigensinurinary-tractinfectionsinchildren[J].Lancet，1977，1：664-666.

[13]RobertsIS.Bacterialpolysaccharidesinsicknessandinhealth[J].Microbiology，1995，141（9）：2023-2031.endprint

1.6体内动态分布试验

将细菌浓度调至1×108CFU/mL，45羽35日龄的SPF鸡，随机分为3组，每组15羽，其中2组分别于左胸的气囊接种0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突变株，还有1组为空白对照。接种24h后，全部扑杀，取心血及肝、脾、肺、肾，称重后研磨，经过稀释后用无抗性的LB固体培养基、kanamycin抗性培养基进行细菌计数，18h后观察结果。

2结果与分析

2.1突变株E058ΔneuC的鉴定

突变株E058ΔneuC经引物neuC-F/neuC-R扩增出1700bp的条带，而亲本株E058扩增出900bp的条带。与预期的结果相一致。

2.2生长曲线

从生长曲线上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生长速度稍慢（图1）。

2.3血清杀菌

在血清杀菌试验中，血清浓度从低到高分别为0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的灭活血清。从图2可以看出血清浓度为5%、12.50%、25%时突变株E058ΔneuC被轻度致弱。

2.4体外竞争

对E058、E058ΔneuC株分别细菌计数至1×108CFU，分别将等量的E058ΔneuC与E058混合于2mLLB培养基中，37℃培养4h。在有、无抗性的LB平板上，根据其计数结果，计算得到E058ΔneuC和E058的CI值为0.65。结果表明，在体外突变株E058ΔneuC毒力被轻度致弱。

2.5体内动态分布

体内动态分布结果，与E058相比，突变株E058ΔneuC的毒力极显著被致弱（图3）。接种24h后，亲本株E058在心脏细菌检出数量为1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、肾中的细菌检出数量为1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突变株在心脏、肝、脾、肺、肾中的细菌检出数量为1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，两者差异达极显著水平。

3结论

禽大肠杆菌作为家禽最常见的病原菌之一，给养禽业造成严重的经济损失。虽然禽大肠杆菌和致病力相关的毒力因子已经相继报道。然而许多毒力因子是通过一系列的感染模型被证明。在自然条件下，大肠杆菌感染动物的发病机理尚未完全清楚，已知致病因子仅能用于解释感染过程中间环节的某些步骤。

NeuC基因与荚膜形成有关，而荚膜是大肠杆菌中重要的毒力因子之一[12]。荚膜有3个区域，其中区域1、区域3主要负责将细菌胞内的高分子聚合物转运到胞外，区域2跟荚膜的形成、激活、聚合等相关联。而neuC基因在区域2中，荚膜能保护菌体免受宿主免疫机制的侵害以及降低巨噬细胞对细菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重组系统构建的E058ΔneuC突变株开展了多项相关动物试验，评价了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的关系。从生长曲线来看，E058ΔneuC突变株的生长速度稍慢。不同浓度的SPF鸡血清中的E058ΔneuC突变株的存活能力有所下降，特别是浓度从5%～25%的鸡血清中，与亲本株比较达到显著的差异水平；体外竞争试验中突变株的CI值都在0.1～1.0之间，突变株轻度致弱；体内动态分布试验结果，E058ΔneuC突变株在受检脏器内的细菌较APECE058株均有不同程度的下降，表明突变株定植于各受检脏器的能力减弱，进而说明突变株的毒力减弱。

综上所述，NeuC基因与APECE058株致病性有较强的关系，并与芯片杂交结果相一致。

参考文献：

[1]CalnekWB.禽病学[M].10版.高福，苏敬良，译.北京：中国农业出版社，1999.

[2]甘孟侯.中国禽病学[M].北京：中国农业出版社，1999.

[3]HarryEG，ChubbLG.RelationshipsbetweencertainbiochemicalcharacteristicsandpathologicalactivityinavianstrainsofE.coli[J].JournalofComparativePathology，1964，74：180-187.

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[5]Dho-MoulinM，vandenBoschJF，GirardeauJP，etal.SurfaceantigensfromEscherichiacoliO2andO78strainsofavianorigin[J].InfectionandImmunity，1990，58（3）：740-745.

[6]NavehMW，ZusmanT，SkutelskyE，etal.AdherencepiliinavianstrainsofEscherichiacoli：effectonpathogenicity[J].AvianDiseases，1984，28（3）：651-661.

[7]WhittamTS，WilsonRA.GeneticrelationshipsamongpathogenicstrainsofavianEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，1988，56（9）：2458-2466.

[8]宦海霞，周琼，赵李祥，等.应用DNA芯片技术研究体外表达禽致病性大肠杆菌可能致病基因[J].微生物学报，2008，48（1）：103-111.

[9]GaoS，LiuXF，ZhangRK，etal.TheisolationandidentificationofpathogenicEscherichiacoliisolatesofchickenoriginfromsomeregionsinChina[J].ActaVeterinariaetZootechnicalSinica，1999，30：164-171.

[10]LiG，LaturnusC，EwersC，etal.IdentificationofgenesrequiredforavianEscherichiacolisepticemiabysignaturetaggedmutagenesis[J].InfectionandImmunity，2005，73：2818-2827.

[11]RussoTA，McFaddenCD，Carlino-MacDonaldUB，etal.IroNfunctionsasasiderophorereceptorandisaurovirulencefactorinanextraintestinalpathogenicisolateofEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，2002，70：7156-7160.

[12]KaijserB，HansonLA，JodalV，etal.FrequencyofE.coliKantigensinurinary-tractinfectionsinchildren[J].Lancet，1977，1：664-666.

[13]RobertsIS.Bacterialpolysaccharidesinsicknessandinhealth[J].Microbiology，1995，141（9）：2023-2031.endprint