一种烟草细菌性病害病原菌分离培养及致病性测定

蒋承耿+瞿鸿飞+王忠宇

摘要：从贵州六盘水烟区采集感病烟株，采用组织分离法进行病原菌分离纯化，并将培养条件进行优化，以南江3号烟草品种为试材，进行病原菌致病性测定。结果表明，该菌培养最适NaCl浓度4%，葡萄糖浓度10%，pH值5～7，培养温度25～30℃，最佳侵染温度20～25℃，相对湿度70%以上，该病害应属于中温高湿侵染病害。

关键词：烟草；病原菌；分离培养；致病性

中图分类号：S435.72 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）11-0072-04

Abstract The isolation and purification of pathogen of a tobacco bacterial disease was conducted from tobacco-growing areas in Liupanshui of Guizhou Province using the issue separation method. Its culture conditions were optimized， and the pathogenicity was measured with Jiangnan 3 as material. The results showed that the optimum growth conditions of this pathogen were 4% of salt concentration， 10% of sugar concentration， 5 to 7 of pH value， and 25～30℃ of cultivation temperature. And the best infesting conditions of this pathogen were 20～25℃ of infesting temperature， and more than 70% of relative humidity. Thus， the disease was easy to infection under middle temperature and high humidity conditions.

Keywords Tobacco； Pathogen； Isolation and culture； Pathogenicity

烟草作为我国重要的经济作物，其产业的良好发展得到广泛关注[1]。而烟草细菌性病害是威胁烟草生产的主要病害之一，其发生普遍且危害严重，严重影响着烟草的质量和产量，进而导致经济效益极大受损。已经报道的细菌性病害有青枯病、细菌性角斑病、野火病、空茎病、细菌性黑杆病等[2-8]。余磊等于2004年报道了云南文山州西畴县和保山市昌宁县发现1种由细菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）侵染引起的烟草新病害[1]。2007年，笔者在贵州省盘县烟区忠义、保田发现一种烟草未知病害，该病害在忠义乡开始零星发生，主要为害烟株中下部叶片叶柄，造成叶片呈水浸状腐烂，发病严重时，烟株中下部茎秆与叶柄连接处开始出现水浸状斑点，最后呈溃疡状腐烂，2009年发生面积达60多公顷，重病田块病株率达100%，严重田块造成绝收，2010年发生面积增大，有逐渐蔓延趋势，严重制约着该地区烤烟生产。本试验对该病的病原菌进行培养条件优化及致病性测定，以明确其生物学特性，为病害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试烟草品种 从盘县忠义发病烟田采回发病烟叶及茎秆（品种：南江3号），室内接种鉴定品种南江3号。

1.1.2 主要试剂 牛肉膏 （北京奥博星生物科技有限责任公司）； 蛋白胨 （北京双旋微生物培养基制品厂）；琼脂 （福建莆田市联邦琼脂有限公司）； NaCl （重庆川江化学试剂厂）。

1.1.3 培养基配方 NA培养基：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，琼脂 20.0 g，pH 6.8～7.0，加水定容到1 000 mL，121℃湿热灭菌20 min。

JNFb培养基：DL-苹果酸5 g·L-1、K2HPO4 0.6 g·L-1，KH2PO4 1.8 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，CaCl2·H2O 0.2 g·L-1，FeEDTA 0.066 g·L-1，溴香酚蓝指示剂2 mL，微量元素2 mL，KOH 4.5 g·L-1，pH 5.8，固体培养基加入琼脂17 g。微量元素成分如下：Na2MoO4·2H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.235 g，H3BO3 0.28 g，CuSO4·5H2O 0.008 g，ZnSO4·7H2O 0.024 g，溶于200 mL蒸馏水中。

1.2 病原菌的分离纯化

病原菌分离参照伯杰氏细菌手册[9]及饶小丽试验方法[10]。将病株茎秆表面用清水洗净晾干，再用85%酒精擦拭，迅速过火烧尽酒精，用消过毒的解剖刀刮去表面皮层，刮其褐色组织，置于无菌培养皿中，滴入2滴无菌水，用无菌玻棒捣碎组织，静置5 min，用玻棒取捣碎组织液在NA培养基上划线，28℃培养48 h。待培养基上长出菌落后，挑取小圆形、稍隆起、白色稀汤状、有光泽菌落于NA培养基上培养，纯化3～4次，然后再挑取单一菌落，置于装有10 mL无菌水的试管中，保存菌种备用。

1.3 病原菌菌悬液制备

用灭菌接种环蘸取1.2中纯化菌种，在NA培养基上划线，于28℃恒温箱中培养。待病原菌在NA培养基上长满培养皿后，取病原菌于3 mL无菌水中配制成菌原液，经系列稀释，配制浓度约1×108 cfu·mL-1的病原菌悬浮液。

1.4 菌体培养条件优化

1.4.1 菌株耐盐性试验 在JNFb培养基中加入NaCl调节盐浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%，以不加NaCl为对照。每处理重复3皿，每皿接种1×106 cfu·mL-1浓度病原菌悬浮液2 mL，在28℃恒温培养箱培养24 h后观测细菌数量，以测定细菌耐盐性。

1.4.2 菌体最适糖浓度试验 在盐浓度为4%的JNFb培养基中分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%葡萄糖，以不加葡萄糖为对照。每处理重复3皿，每皿接种1×106cfu·mL-1病原菌悬浮液2 mL，在28℃恒温培养箱培养24 h后观测细菌数量，以测定最适生长糖浓度。

1.4.3 菌体最适生长酸碱度试验 在盐浓度为4%、葡萄糖浓度为10%的JNFb培养基中采用盐酸和氢氧化钠将pH值分别调为3、4、5、6、7、8、9、10。每处理重复3皿，每皿接种1×106cfu·mL-1病原菌悬浮液2 mL，在28℃恒温培养箱培养24 h后观测细菌数量，以测定菌体最适生长酸碱度。

1.4.4 菌体最适培养温度试验 在盐浓度为4%、葡萄糖浓度为10%、pH值调为5～7的JNFb培养基中每皿接种1×106 cfu·mL-1病原菌悬浮液2 mL，置于在5、10、15、20、25、30、35、40、45℃恒温培养箱培养中。每处理重复3皿，24 h后观测细菌数量，以测定最适培养温度。

1.5 病原菌致病条件

1.5.1 接种浓度试验 调节JNFb液体培养基盐浓度为4%、葡萄糖浓度为10%、pH值为5～7，接种致病菌菌悬液，接种浓度设为1×10、1×102、1×103 、1×104、 1×105、1×106、1×107、1×108 cfu·mL-1，另设清水对照（CK），共9个处理。每处理重复3盆，苗龄40～50 d，接种后常温培养，每天观察致病情况。

1.5.2 致病温度试验 调节JNFb液体培养基盐浓度为4%、葡萄糖浓度为10%、pH值为5～7，致病菌菌悬液接种浓度1×108 cfu·mL-1，接种后置于15、20、25、30、35℃恒温光照培养箱中培养，相对湿度为75%，共5个处理，每处理重复3盆，苗龄40～50 d，每天观察致病情况。

1.5.3 致病湿度试验 调节JNFb液体培养基盐浓度为4%、葡萄糖浓度为10%、pH值为5～7，致病菌菌悬液接种浓度1×108 cfu·mL-1，苗龄40～50 d，接种，置于人工气候室培养，培养温度25℃，湿度设50%、60%、70%、80%、90%共5个处理，每处理重复3盆。每天观察致病情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌培养条件

2.1.1 病原菌耐盐性 在一定盐浓度范围内，该菌生长量随盐浓度增加而增大，在含4%NaCl的培养基中生长量达到最大，而后降低，在盐浓度10%时已不能再生长。表明，所分离到的细菌耐盐性最大不能超过10%，最适生长盐浓度为4% （图1） 。

2.1.2 病原菌培养最适葡萄糖浓度 在不含葡萄糖培养基中，菌体能生长；随着培养基含糖量增加，菌体生长量增大，在含糖量10%时，生长最为旺盛，而后，随含糖量增加，菌体生长量减少，在含糖量达到35%时，菌体依然能够生长，但生长量较小（图2） 。

2.1.3 病原菌培养最适pH值 目标菌在pH 3～10较大范围内都能生长，在pH 5～7之间有较高生长量，当pH值为6时最适合菌体生长（图3）。

2.1.4 病原菌培养最适温度 低于10℃的环境下菌株不能生长；至15℃时，菌株有少量生长，随着温度升高，生长量增大，在30℃生长量最大；然后随温度升高生长量降低，到40℃时依然有少量生长；到45℃时，菌株都不能再生长（图4）。

2.2 病原菌致病条件

2.2.1 最佳接种浓度 1×10、1×102 cfu·mL-1和1×103 cfu·mL-1三个浓度处理未出现过敏性反应；1×104 cfu·mL-1和1×105 cfu·mL-1两个浓度处理在接种后5～6 d出现轻微反应，在接种周围表现叶肉黄化；1×106、1×107 cfu·mL-1和1×108 cfu·mL-1三个浓度处理3～4 d在接种周围表现叶肉黄化，7 d叶柄边缘表现坏死；对照未出现异常反应。表明，最佳接种浓度在1×106 cfu·mL-1以上，随浓度增加，致病性反应加强。

2.2.2 最适致病温度 在15℃时接种后7 d出现接种周围叶肉黄化，10 d叶柄边缘表现坏死；20℃接种后3 d出现致病性反应，接种周围叶肉黄化，10 d叶柄边缘表现坏死；25℃接种后第3 d出现致病性反应，接种周围叶肉黄化，7 d叶柄边缘表现坏死；30℃接种后第4 d出现致病性反应，接种周围叶肉黄化，7 d叶柄边缘表现坏死；35℃接种后5 d出现接种周围叶肉黄化，10 d叶柄边缘表现坏死。表明，在75%相对湿度下，最适侵染温度在20～25℃。

2.2.3 最适侵染湿度 在25℃条件下， 50% RH处理接种后未出现侵染现象；60%RH处理接种后5 d出现接种周围叶肉黄化，6 d叶柄边缘表现坏死； 70% RH处理接种后3 d出现接种周围叶肉黄化，5 d叶柄边缘表现坏死； 80%、90% RH处理接种后2 d出现接种周围叶肉黄化，4 d叶柄边缘表现坏死。表明，最适侵染湿度应在70%以上，属于高湿侵染病害。

3 小结

本试验结果表明，该菌培养最适NaCl浓度为4%，葡萄糖浓度为10%，pH为 5～7，最适培养温度在25～30℃之间。菌株最适侵染浓度在1×106 cfu·mL-1以上，最适侵染温度在20～25℃之间，相对湿度在70%以上侵染速度快，因此该病害应属于中温高湿侵染病害。

参 考 文 献：

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