一种玉米CRISPR/Cas9载体的构建

何春梅+刘铁山+关海英

摘要：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated （Cas） 9 系统由于其突变效率高、制作简单、成本低，被越来越广泛地应用于植物基因组的精确修饰，是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。本研究构建了玉米淀粉合成酶调控因子基因ZmRSR1的CRISPR/Cas9载体系统，为在玉米中实现该基因的定向突变奠定了坚实基础，同时也为玉米基因组的定点突变修饰提供了重要参考。

关键词：CRISPR/Cas9；玉米；基因组编辑；调控因子

中图分类号：S513.01 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）11-0009-04

Abstract As its characteristics of high efficiency， easy manipulation and low cost， the clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated （Cas） 9 system has been widely used in precise modification of plant genome， which is regarded as a molecular tool with a broad application prospect. A detailed protocol of targeted mutagenesis of starch synthase regulatory factor gene ZmRSR1 in maize using the CRISPR/Cas9 system was provided， which might give a reference for site-directed modification of maize genome.

Keywords CRISPR/Cas9；Maize；Genome editing；Regulation factor

随着植物生物技术的发展，利用基因组定点编辑技术对玉米等作物的重要农艺性状进行遗传修饰，创造遗传变异优异材料是促进现代农业可持续发展的有效策略[1]。在现代生物学研究中， 基因组编辑（genome editing）技术是揭示特定基因功能的有效手段。随着越来越多物种全基因组测序的完成，科学家们面临的一个挑战即如何从海量的数据中获得相应基因的功能和应用价值信息，基因组的定点编辑技术是实现这一目标的重要研究工具[2-4]。

在过去十年间，几种序列特异性核酸酶，包括锌指核酸酶（zinc-finger nucleases， ZFNs）、 TALE核酸酶（transcription activator-like effector nucleases， TALENs），能够对单基因、双基因及多基因进行敲除，使定向基因组编辑成为可能。近年来，这些核酸酶已经被成功地应用于植物中，逐渐掀起了植物分子育种与遗传学修饰的一场革命[3，4]。ZFNs 和TALENs包括人造的模块化的DNA结合域和FokⅠ核酸酶域两部分，两个系统中的DNA结合域均可识别一个特定的DNA序列，然而，其蛋白复合物的设计与制备费力又昂贵。2013 年，科学家们发现一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated （Cas） 9系统[2]，该系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，能够由一段人工设计的20 bp的向导RNA（guide RNA， gRNA）通过Watson-Crick碱基配对原则特异地锚定到一段基因组序列上，从而实现对基因组的定点编辑。打靶一个位点只需要在原有载体的基础上替换20～30 bp的核苷酸，相当于合成一对引物，构建过程相对于ZFNs和TALENs更加简单，适合规模化、高通量的组装。尽管该系统发展时间短，但目前该技术已经广泛应用在动物、植物、微生物以及人类医学等各方面[2，5]。

利用CRISPR/Cas9系统编辑植物基因组，干扰某个或某些基因的表达已有许多成功的报道，该技术已被广泛应用于模式植物如烟草和拟南芥[6，7]中，作物如小麦[8]、玉米[9]、水稻[10-13]、高粱[14]、番茄[15]以及柑橘[16]中。在水稻和小麦中，详细的构建定点突变载体的方案也已报道[17]。

Fu等[18]通过基因共表达研究发现了一个与淀粉合成相关的转录调控因子基因RSR1（Rice Starch Regulator 1），该调控因子属于APETALA2/乙烯-响应元素结合蛋白家族转录因子，负调控Ⅰ型淀粉合成酶基因的表达，其功能缺失能够增强种子中淀粉合成酶基因的表达。本试验拟通过克隆与水稻OsRSR1同源的玉米ZmRSR1，构建其CRISPR/Cas9载体系统，详细介绍构建该编辑系统的方法，为后续在玉米中定向突变ZmRSR1、增加种子中淀粉合成酶基因的表达、提高种子淀粉含量奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

CRISPR/Cas9载体pRGEB31由本实验室保存；T4 DNA连接酶、DNA Marker、限制性内切酶、DNA聚合酶均为Biolab公司产品；pGEM-T Easy Vector为Promega公司产品；质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒、普通产物回收试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态均购于天根公司；卡那霉素购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯产品。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 引物设计及片段扩增

根据Fu等[18]报道的水稻OsRSR1基因的扩增引物 T1： 5′-GGGAATAGGGGATGAGGTTG-3′与T2：5′-CCGATGGATGATTTGTTTGC-3′登录NCBI数据库，利用Blast分析获得GenBank序列号对应的cDNA全长，利用此序列在NCBI数据库中进行Blast，获得玉米中相似性最高的序列，将该序列输入玉米基因组数据库maizegdb（http：//www.maizegdb.org/）中进行Blast分析，获得OsRSR1在玉米中的同源基因ZmRSR1的DNA序列及染色体座位。将该序列输入用于搜索CRISPR序列的在线设计软件（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html），从中选择PAM序列合适的序列作为CRISPR序列。

由于本研究所要构建的载体与pRGEB31相比，只是在目标CRISPR序列（20 bp）上不同，因此将目标CRISPR序列设计在引物中，以质粒pRGEB31为模板，通过Overlapping PCR方法获得带有目标序列的全长片段，连入载体pRGEB31中，完成对原来序列的置换。因此，试验前两轮PCR扩增分别以质粒pRGEB31为模板，第一轮扩增分别用载体pRGEB31中的U3启动子序列（U3-Forward）作为上游引物，用CRISPR序列与pRGEB31中一段上游gRNA序列（P1 Re，P2 Re，P3 Re，P4 Re，P5 Re）做下游引物；第二轮扩增用CRISPR序列与pRGEB31中一段上游gRNA序列（P1 Fw，P2 Fw，P3 Fw，P4 Fw，P5 Fw）做上游引物，用载体pRGEB31中gRNA序列（gRNA-Reverse）做下游引物。分别回收两轮扩增产物，合并后作为下一步PCR扩增的模板，以载体pRGEB31中U3启动子序列作为上游引物，以gRNA序列做下游引物，做第三轮Overlapping PCR扩增。回收扩增产物连接到pGEM-T Easy Vector，16℃连接过夜，然后转化大肠杆菌DH5α，提取质粒测序。所用引物序列如表1所示。

1.3 载体构建与鉴定

取测序结果正确的重组质粒和载体pRGEB31分别用HindⅢ和SbfⅠ双酶切，回收酶切产物并建立连接体系，16℃连接过夜，然后转化大肠杆菌DH5α，用卡那霉素筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，取酶切正确的克隆进行测序，得到含有目标序列的重组载体。

2 结果与分析

2.1 ZmRSR1基因CRISPR序列的获得

根据水稻OsRSR1基因信息登录NCBI数据库，利用Blast分析获得玉米中相似性最高的基因序列ZmRSR1。将此基因信息输入用于搜索CRISPR序列及其Cas9基因的在线设计软件（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html），从中选择PAM序列合适的序列作为CRISPR种子序列。共挑选5个CRISPR序列，如表2所示。

2.2 CRISPR序列的扩增及载体构建

试验前两轮PCR扩增以质粒pRGEB31为模板，分别以U3启动子序列、CRISPR序列及gRNA序列设计引物进行PCR扩增，结果如图1a、1b所示，扩增片段均与预期大小一致。两轮PCR产物合并后进行Overlapping PCR，结果如图1c所示，扩增片段与预期大小一致。将产物回收后连入T载体测序。

取鉴定正确的重组子及载体pRGEB31分别用HindⅢ和SbfⅠ双酶切，回收载体片段与623 bp的外源片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，用卡那霉素筛选阳性克隆提质粒进行酶切鉴定。结果如图2所示，所有克隆酶切后均获得与预期大小一致的单一片段，初步判断所筛选克隆全部正确。

将酶切正确的阳性克隆送测序鉴定，将测序结果与预期序列进行比对，所有碱基全部正确无突变（测序结果未显示），即已经在载体pRGEB31中连入正确的CRISPR序列，获得玉米ZmRSR1基因的CRISPR/Cas9重组载体pRGEB31-ZmRSR1-1、pRGEB31-ZmRSR1-2、 pRGEB31-ZmRSR1-3、pRGEB31-ZmRSR1-4及pRGEB31-ZmRSR1-5。

3 小结

http：//www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html[19]能够为8种有代表性的植物提供合适的CRISPR目标序列预测和筛选，我们利用该数据库筛选出玉米ZmRSR1基因5个可能的CRISPR目标序列并将其构建到载体pRGEB31中，该载体为组装好的CRISPR/Cas9载体，能够将gRNA与Cas9蛋白转移到植物中，识别设计的CRISPR序列，对目的基因进行编辑和敲除[20]。结果显示，我们所设计的5个CRISPR目标序列全部替换正确，为后续转化玉米并研究对ZmRSR1基因的编辑效率奠定了基础。

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