血清miR-922及miR-506对儿童急性淋巴细胞白血病诊断及预后判断的价值

朱奕月 吴日暖 李霞 陈祥碧

（1.三亚市妇幼保健院儿科，海南三亚 572000；2.三亚市人民医院儿科，海南三亚 572000）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一种儿童最常见的恶性肿瘤，临床表现主要有贫血、感染及发热等，其发生与基因突变、染色体变异及功能蛋白表达异常等多种因素和机制有关［1］。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类含有18～24个核苷酸的非编码RNA，可特异性调节生物细胞的增殖、分化、凋亡及肿瘤发生过程中相关基因表达，其异常表达与ALL的发生发展、临床表现及预后情况密切相关，有望作为ALL的诊断性标志物和治疗靶点［2-3］。有研究认为，miR-922及miR-506在ALL患者中存在异常表达，其表达水平变化对ALL的发生发展有重要的影响，可能是ALL预后预测及疗效监测的新指标［4-5］。然而，关于miR-922及miR-506能否作为儿童ALL诊断及预后判断的新型生物学指标，目前尚未明确。因此，本研究通过检测ALL患儿血清miR-922及miR-506表达水平，分析其与儿童ALL临床指标的关系，探讨miR-922及miR-506在儿童ALL诊断及预后判断中的价值，旨在为儿童ALL的诊疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 研究对象

前瞻性选取2018年1月至2020年11月三亚市妇幼保健院和三亚市人民医院收治的初诊ALL患儿132例为研究对象，其中男82例，女50例，确诊年龄3～14岁，平均年龄（6.5±1.8）岁。纳入标准：（1）ALL的诊断及分型标准参考《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》［6］；（2）ALL患儿均采用中国儿童白血病协作组（Chinese Children's Leukemia Group，CCLG）-ALL2008方案［7］治疗。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤、血液系统疾病及自身免疫疾病；（2）确诊时已接受过治疗，不能配合本次研究者。根据CCLG-ALL 2008方案的危险度分层标准，将132例ALL患儿分为标危42例，中危56例，高危34例。另招募自愿参与本研究的健康儿童80例作为健康对照组，其中男53例，女27例，年龄5～14岁，平均年龄（6.9±1.4）岁。本研究经我院伦理委员会批准后开展，并签署知情同意书。

1.2 随访方法

通过电话或门诊等方式对患儿进行随访，随访截止时间为2021年5月1日。总生存（overall survival，OS）期指自确诊第1天至患儿死亡的时间。无进展生存（progression-free survival，PFS）期指自确诊第1天至复发或由于疾病进展导致患儿死亡的时间。记录患儿初诊时的临床基线资料、白细胞计数、血红蛋白、融合基因类型、染色体核型及泼尼松反应情况等。

1.3 miR-922及miR-506检测

所有患儿确诊当天和健康对照组儿童体检当天采集静脉血3 mL，3 000 r/min，离心10 min分离血清。应用TRIzol法提取总RNA。采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription逆转录试剂盒（美国Life Technologies公司）以RNA为模板逆转录为cDNA。以U6为内参；miR-922上游引物：5'-ATCGACTATCATCACTGTCA-3'，下游引物：5'-GAGTCACTGTCGATGTGCAT-3'；miR-506上游引物：5'-GCATCGATCAGCAGTATCAG-3'，下游引物：5'-ACTAGTCATAGTCGTACTTG-3'，由上海生工生物有限公司设计并合成。在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行扩增。PCR反应体系为20μL：1μL引物及探针Mix（20×），10μL TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33μL反向转录脱氧核糖核酸，7.67μL双蒸馏水。PCR反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火60 s，45个循环。采用2-△△Ct法计算miR-922及miR-506表达水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两样本t检验。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析miR-922及miR-506对儿童ALL诊断的价值。单因素生存分析应用Kaplan-Meier法，生存率比较行log-rank检验，多因素生存分析应用COX回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALL组和健康对照组血清miR-922及miR-506表达水平变化

ALL组血清miR-922及miR-506表达水平均明显高于健康对照组，差异均有统计学意义（P<0.001），见表1。

表1 ALL组和健康对照组血清miR-922及miR-506表达水平比较 （±s）

表1 ALL组和健康对照组血清miR-922及miR-506表达水平比较 （±s）

组别健康对照组ALL组t值P值n 80 132 miR-922 0.86±0.27 2.35±0.93 13.628<0.001 miR-506 1.04±0.38 3.72±1.36 19.165<0.001

2.2 miR-922及miR-506对儿童ALL诊断的价值

血清miR-922表达水平诊断儿童ALL的最佳截断值为1.46，曲线下面积为0.842（95%CI：0.785～0.904），其灵敏度为86.2%，特异度为80.3%，约登指数为0.665。血清miR-506表达水平诊断儿童ALL的最佳截断值为2.17，曲线下面积为0.875（95%CI：0.812～0.936），其灵敏度为88.5%，特异度为83.7%，约登指数为0.721。见图1。

图1 miR-922及miR-506诊断儿童ALL的ROC曲线

2.3 miR-922及miR-506表达与ALL患儿临床特征的关系

以miR-922=1.46及miR-506=2.17为界值，将132例ALL患儿分为高表达miR-922组（miR-922≥1.46，n=87）和 低 表 达miR-922组（miR-922<1.46，n=45）；高表达miR-506组（miR-506≥2.17，n=92）和低表达miR-506组（miR-506<2.17，n=40）。miR-922及miR-506高表达组患儿的淋巴结肿大、白细胞计数≥50×109/L、中高危险度分层、MLL基因重排、染色体核型异常的发生率均明显高于miR-922及miR-506低表达组（P<0.05），见表2。

表2 （续）

表2 miR-922及miR-506表达与ALL患儿临床特征的关系 ［例（%）］

2.4 miR-922及miR-506表达与ALL患儿预后不良的关系

132例ALL患儿随访时间为5～27个月，中位随访时间为12.4个月，中位生存时间为18.5个月。生存分析显示，miR-922高表达组患儿中位生存时间为17.2个月，miR-922低表达组患儿中位生存时间为19.6个月；miR-922高表达组患儿OS率明显低于miR-922低表达组（χ2=10.172，P=0.001）；miR-922高表达组患儿PFS率明显低于miR-922低表达组（χ2=8.473，P=0.006）（图2）。miR-506高表达组患儿中位生存时间为15.7个月，miR-506低表达组患儿中位生存时间为20.8个月；miR-506高表达组患儿OS率明显低于miR-506低表达组（χ2=14.613，P<0.001）；miR-506高表达组患儿PFS率明显低于miR-506低表达组（χ2=11.508，P<0.001）（图3）。

图2 miR-922高表达组与低表达组ALL患儿的OS率及PFS率比较

图3 miR-506高表达组与低表达组ALL患儿的OS率及PFS率比较

2.5 ALL患儿预后不良的多因素COX回归分析

将淋巴结肿大、白细胞计数、危险度分层、MLL基因重排、染色体核型、miR-922及miR-506等自变量纳入ALL患儿预后不良的多因素COX回归分析，结果显示：白细胞计数≥50×109/L的患儿预后不良的发生风险是白细胞计数<50×109/L患儿的1.985倍（P<0.05），危险度分层为中高危的患儿预后不良的发生风险是标危患儿的2.485倍（P<0.05），有MLL基因重排患儿预后不良的发生风险是无MLL基因重排患儿的3.715倍（P<0.05），miR-922≥1.46的患儿预后不良的发生风险是miR-922<1.46患儿的2.113倍（P<0.05），miR-506≥2.17的患儿预后不良的发生风险是miR-506<2.17患儿的2.854倍（P<0.05），见表3。

表3 ALL患儿预后不良的多因素COX回归分析

3 讨论

近年来，随着医学技术的不断发展，使得我们能较好地对ALL进行诊断、风险分层和指导治疗，儿童ALL生存率也有了很大的提高，但仍有20%～30%的儿童ALL在治疗后出现复发，且复发患儿治疗难度大，预后较差，严重影响了患儿的生存状况［8］。因此，找到指导ALL诊断及预后判断的灵敏度和特异度高的新型生物学指标对ALL的治疗具有重大价值。miRNA是一类高度保守的非蛋白编码的单链RNA分子，通过参与白血病细胞激活、增殖、分化、凋亡及信号通路转导，在白血病的发生发展和预后中起到关键作用，对白血病的诊断、分期和预后评估等方面具有重要价值［9］。Nair等［10］研究认为，miRNA的异常表达与细胞生长、凋亡和细胞周期调控等发生变化有关，并在白血病的发病机制、病情进展及个体化治疗中起到较大的作用。另有研究表明，miRNA通过对蛋白质翻译过程和mRNA转录的影响，参与了ALL的发生和发展，对ALL的诊断、病情监测和靶向治疗具有重要帮助［11］。

本研究显示，ALL组血清miR-922及miR-506表达水平均明显高于健康对照组，提示miR-922及miR-506在ALL患儿中异常高表达，其可能通过发挥癌基因的作用来参与ALL的发病过程。Rostami等［12］研究显示，miR-506是一种致癌的miRNA，miR-506的过度表达可导致癌细胞的增加和ALL的发展，可能为ALL的治疗提供新的方向。Ultimo等［13］研究发现，miRNA在ALL中存在异常表达，miRNA失调与ALL的侵袭及转移有关，有可能在ALL的发病机制及治疗中发挥关键作用。本研究ROC曲线分析结果显示，miR-922的截断值为1.46及miR-506的截断值为2.17时，miR-922及miR-506诊断儿童ALL的曲线下面积、灵敏度和特异度均较好，说明miR-922及miR-506对儿童ALL诊断具有良好的价值，有望作为诊断儿童ALL的生物学指标。

本研究中有淋巴结肿大、白细胞计数≥50×109/L、中高危险度分层、MLL基因重排及染色体核型异常的患儿miR-922及miR-506表达水平较高，提示miR-922及miR-506的高表达可能参与ALL的进展过程，在促进ALL发展中起到一定的作用。Rashed等［14］研究显示，miRNA的表达失调对ALL的进展及预后有显著影响，可能是ALL预后判断的无创性生物标志物。Tapeh等［15］研究认为，miRNA的异常表达对ALL基因调控的机制及其对细胞增殖、转移、预后和凋亡的影响，将为ALL的靶向治疗带来新的治疗策略。本研究分析miR-922及miR-506表达与ALL患儿生存及进展情况的关系，结果显示miR-922和miR-506高表达组患儿OS率明显低于miR-922和miR-506低表达组，miR-922和miR-506高表达组患儿PFS率明显低于miR-922和miR-506低表达组。这说明miR-922及miR-506高表达与ALL患儿的生存期短有关。此外，本研究进一步分析影响ALL患儿预后的相关因素，显示白细胞计数≥50×109/L、危险度分层、MLL基因重排、miR-922≥1.46及miR-506≥2.17是导致ALL患儿预后不良的独立危险因素。王瑞仓等［16］研究也发现，白细胞计数、危险程度分层与儿童ALL的发展及预后有关，可作为ALL患儿预后判断的参考指标。金芬芬等［17］研究指出，MLL基因重排及白细胞计数≥50×109/L患儿的预后明显较差、复发率较高，与ALL患儿的OS率和PFS率短有关，是影响ALL患儿预后的独立危险因素，有助于判断ALL患儿的预后及预测复发。另有研究表明，miRNA作为一种新的表观遗传调控因子，与ALL的发生、进展密切相关，可作为ALL进展和复发的生物标志物，为ALL的诊断、治疗和预后提供了重要的依据［18］。

综上所述，ALL患儿血清miR-922及miR-506表达水平明显升高，其高表达是ALL患儿预后不良的危险因素，miR-922及miR-506对儿童ALL诊断及预后判断均具有较好的价值。但本研究尚处于初步探索阶段，有关miR-922及miR-506对ALL具体发病机制、危险分层及其靶向治疗的作用仍需更进一步深入研究。