2017～2019年儿童诺如病毒相关性胃肠炎的分子流行病学研究

段美霖 胡月 唐香 许红梅

（重庆医科大学附属儿童医院感染科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014）

诺如病毒是引起儿童病毒性腹泻的主要病原体之一，也是导致全球所有年龄段人群食源性疾病和胃肠炎暴发的主要原因［1］。诺如病毒相关性胃肠炎临床上以呕吐、腹泻为主要表现，可伴有发热、恶心、腹痛、厌食、乏力、惊厥等［2］，虽然大多数患者感染程度较轻，但也有出现住院、死亡等重症病例，特别是在5岁以下儿童、65岁以上老年人和免疫力低下者［3］。据统计，诺如病毒每年可导致12%～24%的社区或诊所胃肠炎病例、11%～17%的急诊室或住院病例，以及大约7～20万人死亡，且在儿童中发病率最高［1］。由此给全球带来的社会经济损失可高达603亿美元［4］。

诺如病毒属于杯状病毒科诺如病毒属，无包膜单股正链的RNA病毒。人诺如病毒基因组包括3个开放阅读框（open reading frames，ORFs），编码结构蛋白和非结构蛋白。根据衣壳区及聚合酶区基因序列，可分为10个基因组（GⅠ-GⅩ）及8个P组，包括49个衣壳基因型及60个P型［5］。GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅧ及GⅨ可感染人，而最为常见的为GⅠ和GⅡ［6］。诺如病毒具有高变异性，持续检测儿童诺如病毒相关性胃肠炎的病原学特征、基因型变迁，有助于诺如病毒感染的预防和控制。本研究对2017～2019年期间在重庆医科大学附属儿童医院门诊就诊的1 458例急性胃肠炎患儿中诺如病毒的分子流行病学特征进行分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性收集2017年1月至2019年12月期间就诊于重庆医科大学附属儿童医院的急性胃肠炎患儿1 456例的临床资料。所有患儿均符合急性肠胃炎诊断标准［7］及纳入标准：（1）大便次数增加（每日排便次数3次或以上）；（2）粪便性状改变（包括水样便、稀便）；（3）大便常规提示白细胞及红细胞计数均≤10个/高倍镜视野（+）；（4）病程不超过2周。本研究已获得我院医学伦理委员会批准［（2020）年伦审（研）第（154）号］。

1.2 样本的处理和病毒RNA提取

共采集粪便样本1 458份，其中2例患儿分别于不同病程各采集1份粪便样本，男860份，女598份。取0.2 mL大便样本或豌豆大小粪便量，加入0.8 mL PBS缓冲溶液，充分混匀配制成20%的混悬液，离心后获取上清液，采用德国QIAGEN公司病毒核酸提取试剂盒，严格按照试剂盒说明书，提取病毒RNA。

1.3 VP1区序列扩增及测序

采用美国Invitrogen公司RNA逆转录试剂盒逆转 录 合 成cDNA，选 择GISKF/GISKR（GI）、CoG2F/G2SKR（GII）作为引物［8］，应用大连宝生物有限公司的TaKaRa Premix Taq试剂盒扩增诺如病毒的VP1区序列。反应体系：上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，dNTP Mix（2.5 mol/L）2.0μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.15μL，ddH2O 13.35μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；最后72℃延伸7 min，4℃终止。将1.5%琼脂糖凝胶电泳阳性的PCR产物外送上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.4 序列分析

采用DNAstar软件对测定序列进行编辑，利用PubMed在线BLAST功能进行比对，诺如病毒基因在线分型工具（https：//www.rivm.nl/mpf/typingtool/norovirus/）检索其基因型。应用MEGA 5.05软件进行多序列比对，使用Neighbor-joining法、Kimura2-parameter模型构建亲缘进化树，Bootstrap检验进化树的可靠性，重复检验1 000次。

1.5 统计学分析

使用SPSS 23.0统计软件对数据进行统计学分析，计数资料用频数和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 诺如病毒检测结果

2017～2019年采集符合纳入标准的儿童腹泻样本1 458份，诺如病毒阳性检出率为10.84%（158/1 458）；2017年阳性检出率为10.0%（48/482），2018年阳性检出率为12.3%（60/489），2019年阳性检出率为10.3%（50/487），不同年份诺如病毒阳性检出率比较差异无统计学意义（χ2=1.588，P>0.05）。检出的诺如病毒主要为GⅡ型（97.5%，154/158），GⅠ型仅4例（2.5%，4/158）。

2.2 诺如病毒感染性别分布

158例诺如病毒阳性患儿中，男性检出率为12.2%（105/860），女性检出率为8.9%（53/598），男性检出率明显高于女性（χ2=4.088，P=0.043）。

2.3 诺如病毒感染年龄分布

纳入研究的患儿年龄分布从1月龄至165月龄，依次分为<6月龄、6月龄～、12月龄～、18月龄～、24月龄～、≥36月龄组，诺如病毒阳性率分别为3.1%（9/292）、13.5%（66/490）、16.9%（51/301）、13.4%（19/142）、6.2%（6/97）、5.1%（7/136），各年龄组间诺如病毒阳性率比较差异有统计学意义（χ2=40.982，P<0.001）。儿童诺如病毒相关性胃肠炎的发病年龄以小于2岁为主，占比为95.6%（151/158）。诺如病毒阳性率最高的年龄组为12～<18月龄组（16.9%），占所有诺如病毒阳性患儿的32.3%（51/158）。

2.4 诺如病毒感染时间分布

2017～2019年儿童诺如病毒相关性胃肠炎的各月监测结果分析显示，诺如病毒感染流行月份主要为8～10月份，不同年份略有波动。2017年诺如病毒检出高峰在8、9月份，检出率分别为32%（13/41）、31%（21/67）；2018年诺如病毒检出高峰在9、10月份，检出率分别为28%（13/47）、40%（16/40），同年5月份有一个小高峰，检出率为25%（4/16）；2019年诺如病毒检出高峰在9、10月份，检出率分别为31%（15/48）、33%（20/60）。见图1。

图1 2017～2019年重庆地区儿童诺如病毒性胃肠炎病例的月份分布情况

2.5 诺如病毒感染临床特征

诺如病毒阳性患儿临床上以腹泻（100%，158/158）为主要表现，可伴随呕吐（79.1%，125/158）、发热（29.1%，46/158）、腹痛（1.3%，2/158）、脱水（1.3%，2/158）、精神萎靡（1.3%，2/158）等症状。92.4%（146/158）的患儿粪便性状呈水样便，少数为稀便（7.6%，12/158）；大便常规显示有28例患儿检出白细胞［≤10个/高倍镜视野（+）］，4例患儿检出红细胞［≤10个/高倍镜视野（+）］，合并轮状病毒（胶体金法检测）感染有23例（14.6%）。

2.6 诺如病毒的基因型分布

经过核酸序列比，在158份阳性样本中共检出8种基因亚型，其中以GⅡ.4为主，占69.6%（110/158），且99份为GⅡ.4 Sydney 2012，占62.7%（99/158）；其次为GⅡ.3，占15.2%（24/158）；GⅡ.2占10.1%（16/158）；GⅡ.6占1.9%（3/158）；GⅡ.17占0.6%（1/158）；GⅠ.3占1.3%（2/158）；GⅠ.2、GI.5各占0.6%（1/158）。GⅡ.4 Sydney 2012在2017～2019年每年都占有明显优势，在7～12月份为主要流行株，但2～4月却无检出。在1月和3～5月，GⅡ.3则成为主要流行株。GⅡ.6、GⅡ.17、GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.5散发在不同月份，且2017年无GⅠ检出，2018年、2019年各检出2例。见图2。

图2 2017～2019年重庆地区儿童诺如病毒性胃肠炎的基因型分布

随机选取各基因型代表序列与GenBank数据库中下载的参考株，构建诺如病毒衣壳区的分子遗传进化树。本研究中15株GⅡ.4 Sydney 2012毒株与台湾株GⅡ.4 Sydney 2012 MH979230.1在同一遗传支，同源性在96.8%～100%；13株GⅡ.3毒株与浙江株GⅡ.3 KY433576.1同源性在97.0%～100%；13株GⅡ.2毒株与俄国株GⅡ.2 MK886705.1同源性在98.3%～100%；3株GⅡ.6毒株与巴西株GⅡ.6 KX154761.1同源性在99.3%～99.7%；1株GⅡ.17毒株与江苏株GⅡ.17 KU720506.1同源性为100%；1株GⅠ.5毒株与韩国株GI.5 MN494557.1同源性为99.7%；2株GⅠ.3毒株与韩国株GⅠ.3 MW532368.1同源性在93.4%～100%，其中GI.3 CQNV42012018CHN与韩国株GI.3 MN421672.1同源性在99.7%；1株GⅠ.2与俄国株GI.2 MF615618.1同源性为98.4%。见图3。

图3 诺如病毒衣壳区系统进化树

3 讨论

诺如病毒是导致儿童急性病毒性腹泻第2位病原，在部分地区甚至越居第1位［9］，因而越来越受到重视，但目前诺如病毒疫苗仍处于研发阶段，进展最快的候选疫苗处于临床实验的IIb期［10］，迄今为止尚无有效的上市疫苗。因此，对诺如病毒流行特征及基因型变迁的监测至关重要。

本研究显示2017～2019年1 458份急性胃肠炎患儿粪便标本中，3年诺如病毒的检出率分别为10.0%、12.3%、10.3%，总检出率为10.84%。相比于同地区2012～2014年的诺如病毒检出率（21.9%、15.6%、13.1%）均降低［11-13］，但与2015年的诺如病毒检出率10.7%相当［14］。这提示2017～2019年诺如病毒阳性率波动幅度较小，较2012～2014年有下降趋势，一方面可能与本地区经济发展、卫生条件改善相关；另一方面可能与监护人健康意识的提高，轻症腹泻自行予以对症处理有关。与同时间段我国南北城市的诺如病毒监测情况比较，云南省疾病预防控制中心调查显示自云南、四川等省的各腹泻监测点采集2017～2019年的儿童腹泻样本中有10.43%检出诺如病毒［15］，本地区与之相当，但李洁等［16］监测数据显示北京地区诺如病毒检出率为7.5%，石鑫等［17］收集黑龙江哨点医院腹泻标本研究诺如病毒感染的流行特征时发现7.14%的样本检出诺如病毒。

上述中国南北方诺如病毒阳性率的差异，可能与经济、气候、居住环境、饮食生活习惯、健康意识、人群易感性等有关，而这一方面的研究国内少见。据报道，湿度变化有利于轮状病毒的持久性，增加了通过受污染表面传播的风险［18］，由此推测湿度可能也会影响诺如病毒的持久性。也有研究表明极端天气变化可能影响病毒性胃肠炎的发生，例如厄尔尼诺南方涛动，就被确认是病毒性胃肠炎发生的重要危险因素［19］。而具体到诺如病毒而言，包括湿度、温度、降雨、大风、洪水等多种环境因素，对诺如病毒感染是否具有影响，需要诺如病毒与气候条件的同步监测，以进一步研究。人群对诺如病毒易感性很大程度取决于肠道上皮表面是否存在组织血型抗原和非分泌者的岩藻糖转移酶2基因突变，从而导致相应酶的活性丧失，肠道上皮细胞不能表达血型抗原，从而抵抗大部分诺如病毒的显性感染，非分泌者感染诺如病毒的风险低于分泌者［20］。对于我国不同区域人群组织血型抗原表达情况与诺如病毒感染的关系，仍然需要进一步研究。

本研究结果显示诺如病毒流行高峰在8～10月份，与本地区既往监测情况大致相当［11-12］。在中国中部地区，例如湖北省则以10～12月份为流行高峰［21］，而黑龙江、北京等北方地区，流行高峰却在2月份［16-17］。诺如病毒全球季节模式显示其流行高峰期在冬季，提示温度与诺如病毒流行存在一定相关，同时研究亦有提出降雨量与季节性存在正相关［22］。我国不同区域的诺如病毒流行的月份差异亦有可能与气温、降雨量有关。而这种差异性，或许对今后不同区域的疫苗接种时间的决策提供参考。

儿童诺如病毒相关性胃肠炎的发病年龄以小于2岁为主。诺如病毒阳性率最低的年龄组为<6月龄（3.1%），考虑可能与从母体获得的保护性抗体有关，同时亦可能与这一年龄阶段患儿活动范围小，接触感染的机会较低有关。本研究男性患儿诺如病毒阳性率较女性患儿更高，男性被认为是儿童诺如病毒相关性胃肠炎的危险因素［23］，这可能与男性患儿卫生意识较低，活动范围较广，接触病毒感染的机会更多有关。

本研究结果显示儿童急性胃肠炎中诺如病毒感染仍以GII.4为主，这与我国多省市地区监测结果相符［24］。由于诺如病毒具有高变异性，在抗原漂移、基因重组的双重作用下，约每2～4年便会出现一个新的GII.4变异株以替代既往流行的GII.4变异株，但自2012年来，GII.4 Sydney 2012一直持续流行［25］，本研究亦显示了GII.4 Sydney 2012为本地区2017～2019年流行的主要流行株。有研究认为带有GⅡ.4 Sydney 2012衣壳的病毒通过重组进化持续存在［25］。

GII.3在人群中长期广泛流行，在本研究中GII.3处在诺如病毒基因型检出的第2位，而何菲等［26］研究天津市儿童GII感染情况时则发现GII.3检出率甚至高于GII.4，但根据全球数据显示，GII.3仍是次于GII.4的导致儿童诺如病毒相关性胃肠炎的基因型［23］，对于GII.3今后是否超越GII.4成为主要优势株，需要进一步监测。GII.17自1978年第1次报道以来，常为零星感染，而且该基因型较GII.4、GII.3在成年人的暴发感染中更常见［27］，而在2014～2015年，GII.17在亚洲部分地区，例如中国广东地区及日本［27-28］，短暂替代GII.4 Sydney 2012，成为诺如病毒暴发流行的主要基因型，而后该基因型再次呈现零星感染，主要流行株仍为GII.4 Sydney 2012。GI在人群中感染率较低，根据Mans等［29］对1997～2018年诺如病毒流行病学及基因型分布的相关数据进行统计和分析，结果显示GI基因组中最为流行的毒株为GI.3基因型。本研究中GI在2017年未检出，这与本地区既往2012年、2014年、2015年未检出结果一致［11-12，14］，但在2018及2019年各检出2例，说明今后本地区需注意GI感染的监测。大体上看本地区GI感染率低，基本符合全球范围内流行趋势，GI基因组在人群中感染率较低，或许与其变异性较低、病毒间交叉保护作用等相关。

综上所述，本研究显示2017～2019年间诺如病毒仍是引起儿童急性胃肠炎中的重要病原之一，阳性率为10.84%。其流行高峰在8～10月份，儿童诺如病毒相关性胃肠炎的发病年龄以小于2岁为主，男性患儿诺如病毒阳性率较女性患儿更高。GII.4 Sydney 2012为主要流行株，GII.3、GII.2次之，GI偶有检出。诺如病毒的流行病学受到地区经济、气候、居住环境、饮食生活习惯、健康意识、人群易感性等多方面因素影响，对儿童诺如病毒相关性胃肠炎的时间分布、人群分布、临床特征、基因型分布等的持续监测，可为本地区儿童诺如病毒相关性胃肠炎的预防与控制提供重要支持。