孕期胆碱缺乏影响子代宫内生长及糖脂代谢的动物模型 研究

吴洁，张黎黎，李艳红，张娴，寸丽苹

(昆明医科大学第二附属医院，云南 昆明 650101)

0 引言

胆碱是人体必需营养素之一，其主要生理功能包括：神经传导、生物膜的信号传递、脂肪转运和一碳代谢[1]。尽管胆碱较为广泛的存在于日常膳食中，但由于膳食不均衡、胆碱代谢关键酶基因多态性差异、孕期和哺乳期需求量相对增加等原因，导致大部分孕妇的膳食胆碱摄入量未达到适宜摄入量[2]。孕期胆碱摄入不足不但影响孕妇自身健康，而且干扰胎儿代谢稳态，影响子代健康。有研究提示胆碱补充可以拮抗肥胖小鼠的胰岛素抵抗发生，孕期补充胆碱可拮抗能影响妊娠期糖尿病所导致的子代脂代谢紊乱，提示孕期胆碱水平可能影响子代的糖脂代谢稳态。现实状况中胆碱缺乏较为常见，本研究拟构建孕期胆碱摄入不足的跨代动物模型，探讨孕期胆碱摄入不足对子代糖脂代谢的影响。

1 材料

1.1 实验动物

选用7周龄C57BL/6小鼠，动物登记为SPF级，雌性20只，雄性10只，由上海市计划生育科学研究所实验动物经营部购进，实验动物许可证: SCXK(沪)2018-0006，垫料、饲料由上海市计划生育科学研究所实验动物经营部提供。实验场所由上海市实验动物研究中心提供。动物饲养条件：温度24°C-26°C，空气湿度40%-70%，12h光照/黑暗循环，标准小鼠箱饲养，实验过程中小鼠均自由摄食饮水，适应性喂养1周后开始造模。

1.2 主要试剂

实验动物的胆碱缺乏饲料购自美国Research Diets公司。小鼠血清胰岛素采用酶联免疫吸附试剂盒为美国Bio TSZ Trust Specialty Zeal 公司的小鼠胰岛素ELISA试剂盒。

2 孕期不同胆碱摄入的实验动物模型构建方法

2.1 母鼠胆碱营养状态及分组

7周龄C57BL/6J小鼠正常饮食喂养适应1周后，按照雌雄比2:1的比例合笼，合笼后以观察到雌鼠阴栓确认怀孕。确认怀孕后孕鼠单笼饲养并随机分组，给予不同胆碱含量的饲料喂养。由于市场尚无不同胆碱含量的动物饲料，仅有无胆碱饲料，因此采用无胆碱饲料添加不同含量的氯化胆碱以导致不同程度的胆碱摄入不足。根据既往研究报道，小鼠标准饲料的胆碱含量是1.4g氯化胆碱/kg饲料。将孕鼠随机分为组：A组：给予标准胆碱饮食(无胆碱饲料+1.4g氯化胆碱/kg饲料)，B组：给予1/2标准胆碱饮食(无胆碱饲料+0.7g氯化胆碱/kg饲料)，C组：给予1/4标准胆碱饮食(无胆碱饲料+0.35g氯化胆碱/kg饲料)，D组：给予无胆碱饮食(无胆碱饲料，不添加氯化胆碱)。所有小鼠均自由摄食、摄水。每周称量并母鼠妊娠期每周测量一次体重及摄食量(摄食量=总饲料量-剩余饲料量-撒料)。

表2 不同胆碱摄入组孕鼠所生小鼠的糖脂代谢指标(±s)

表2 不同胆碱摄入组孕鼠所生小鼠的糖脂代谢指标(±s)

指标组别 血糖(mmol/L) 胰岛素(µU/mL) 总胆固醇(µg/µL) 甘油三酯(mmol/L) HOMO-IR A组 3.29±1.25 0.89±0.18 1.56±0.34 1.29±0.17 0.12±0.02 B组 3.76±0.98 1.09±0.24 1.90±0.44 1.67±0.81 0.23±0.06 C组 3.03±1.07 1.32±0.43 1.77±0.90 1.29±0.17 0.23±0.09 D组 2.98±1.25 1.06±0.09 1.86±0.34 1.94±0.36 0.16±0.03 P值 0.671 0.344 0.787 0.940 0.598

2.2 子代糖脂代谢异常的模型构建

新生子鼠出生后，麻醉后处死，从眼眶静脉丛采血，立即4000r/min，常温离心5min后取血清，置于-80℃冰箱保存进行血清胰岛素、血糖、甘油三酯、总胆固醇的测定。

2.3 糖脂代谢指标的测定和评估

小鼠血清胰岛素采用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定，试剂盒为美国Bio TSZ Trust Specialty Zeal 公司的小鼠胰岛素ELISA试剂盒，操作方法严格按照试剂盒操作说明书进行。血糖、甘油三酯、总胆固醇采用美国贝克曼AU5800(BECKMAN COULTER AU5800)全自动生化分析仪测定。采用稳态模型胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment - insulin resistance, HOMA-IR)来评估新生子鼠的胰岛素敏感性，HOMA-IR=空腹胰岛素(uU/mL)×空腹血糖(mmol/L)/ 22.5[3]。

2.4 统计学分析

数据录入采用Excel软件录入，再导入SPSS 23.0 统计软件进行统计分析。计量资料且服从正态分布的用±s描述，不同胆碱营养水平组别的指标比较使用单因素方差分析(One Way ANOVA)，多组均数两两比较采用LSD法。以α=0.05为检验显著性标准。

3 结果

3.1 母鼠孕期体重增长和摄食情况

四组不同胆碱营养饲养组母鼠孕期体重增长有明显统计学差异，D组孕鼠的孕期增重明显低于A组小鼠，平均每天摄食量亦差异无统计学意义(表1)。

表1 不同胆碱摄入组别母鼠孕期增重和摄食量比较(±s)

表1 不同胆碱摄入组别母鼠孕期增重和摄食量比较(±s)

注：a孕期增重=分娩当日体重-确认怀孕时体重，4组小鼠孕期增重比较，差异具有统计学意义，两两比较结果显示A组和D组的差异具有统计学意义(P=0.01)。b平均摄食量=(总饲料量-剩余饲料量-撒料)/怀孕天数，4组小鼠孕期平均摄食量比较P=0.34。

指标组别 A组 B组 C组 D组a孕期增重(g) 5.40±0.79 5.77±0.98 4.92±0.65 4.63±0.5 b平均摄食量(g/d) 8.23±0.82 7.78±0.64 8.06±0.98 7.98±0.83

3.2 孕期胆碱摄入不足对新生小鼠出生体重的影响

采用比较4组新生小鼠的出生体重，结果显示(见图1)：单因素方差分析结果显示不同组别新生小鼠的出生体重存在差异(F=3.467，P=0.019)，两两比较结果显示孕期无胆碱饮食组(D组)所生的小鼠出生体重(1.47±0.33)g明显低于标准胆碱饮食组(A组)(1.89±0.47)g(P=0.023)。

图1 不同孕期胆碱营养组新生子鼠出生体重比较

3.3 孕期胆碱摄入不足对新生小鼠糖脂代谢生化指标的影响

比较不同胆碱摄入组别孕期所生小鼠的糖脂代谢指标，结果显示新生新生小鼠的血糖、胰岛素、总胆固醇、甘油三酯、HOMO-IR差异无统计学意义(P>0.05)。

4 讨论

最近美国的一项膳食调查发现仅有10%的普通人群和8%的孕妇满足他们相应性别和生理阶段所需的胆碱适宜摄入量[4]，英国的一项孕妇的膳食调查结果显示仅有18%的孕妇膳食胆碱摄入达到适宜摄入量[5]。均提示孕妇人群中胆碱摄入不足并不少见，但孕期胆碱摄入不足对胎儿的影响知之甚少。

本研究构建了孕期小鼠胆碱摄入不足和缺乏的跨代动物模型，探讨孕期胆碱摄入对子代健康的影响。结果发现：孕期胆碱摄入缺乏孕鼠所生新生子鼠的出生体重明显降低，提示孕期胆碱摄入缺乏可能会影响胎儿体重。该结果与西班牙的一项人群研究结果类似，该研究发现低出生体重儿的脐血胆碱水平较低[6]。胆碱在胆碱脱氢酶的作用下，通过氧化反应形成甜菜碱，在同型半胱氨酸甲基转移酶的催化下，提供一个甲基形成体内通用的甲基供体——S-腺苷甲硫氨酸(Sadenosylmethionine，SAM)，广泛参与后续的DNA、蛋白质等甲基化过程。基于胆碱的此种代谢机制，推测孕期胆碱摄入不足可通过影响子代的甲基化修饰，导致表观遗传遗传改变，从而影响胎儿的宫内生长发育[7]。其中的机制可能与孕期胆碱营养可影响胎盘功能有关。有研究提示对胎盘功能受损的小鼠模型的雌鼠交配前5天开始补充不同剂量(1、2、4倍)的胆碱，结果发现补充4倍胆碱剂量可以增加妊娠早期和中期的胎鼠和胎盘重量[8]。提示孕期胆碱营养可能通过影响胎盘功能，从而影响子代宫内生长发育。

本研究构建了孕期小鼠胆碱摄入不足和缺乏影响子代健康的跨代动物模型，可为下一步从表观遗传学机制探讨孕期胆碱对胎儿生长发育的影响机制研究构建基础。由于胆碱在脂肪酸的分解代谢、脂肪细胞的合成、肝脏的脂肪转运过程中有着至关重要的作用[9]。因此，母亲孕期胆碱状态可能影响血脂水平，影响胎盘供给胎儿的血脂状态，从而影响胎儿的脂代谢[10,11]。同时有动物实验提示胆碱、甜菜碱与胰岛素抵抗存在相关性[12-14]。基于以上提示，本研究检测了新生小鼠的糖脂代谢指标和胰岛素抵抗指标，但未能发现孕期胆碱摄入不足或缺乏对新生小鼠血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇和HOMO-IR有显著影响。与上述研究存在不一致性，原因可能是体内糖脂代谢、胰岛素抵抗的代谢过程、以及胎儿宫内生长发育过程非常复杂，特别是胆碱是重要的一碳代谢供体，参与了DNA甲基化修饰这一重要的表观遗传机制。表观遗传的对代谢的调控影响可能不会在子代出生时立刻显现出来，可能会给子代打上遗传印记，当出生后环境变化时出现相应的表型改变。研究者发现在高脂饮食诱导的孕期糖尿病大鼠模型中发现：给孕鼠补充胆碱可以预防孕中期胎儿体重的过度增长，其作用机理在于孕期胆碱补充可抑制胎盘mTOR信号通路，该信号通路可促进胎盘葡萄糖和脂肪的转运[15]。在高脂饮食诱导的大鼠模型中发现补充甲基化供体饮食可减轻脂肪肝，修饰脂肪酸合成相关基因的甲基化水平，从而影响脂肪酸的合成[16]。有研究者在高脂饮食喂养导致肥胖的大鼠模型中发现，孕期补充胆碱显著降低胎鼠肝脏脂肪酸合成相关基因Acc1, Fads, Elovl5, Srebp1c的microRNA富集，下调子鼠的肝脏脂肪酸合成[17]。

综上，本研究成功构建了孕期胆碱缺乏影响子代糖脂代谢稳态的跨代动物模型，发现孕期胆碱缺乏小鼠孕期增重和新生子鼠的出生体重明显降低，提示孕期胆碱营养缺乏可影响胎鼠宫内生长发育。但未发现孕期胆碱营养缺乏对子代糖脂代谢生化指标有显著影响，下一步可以从表观遗传调控机制深入研究孕期胆碱营养不足对子代糖脂代谢稳态及健康的影响，