高效液相色谱法同时测定五虫化瘀通络胶囊中3 种活性成分

荣娟娟 祁 俊 韩晓珂 徐 斌 陈 娟 王 权

安徽省芜湖市中医医院制剂室，安徽芜湖 241000

五虫化瘀通络胶囊（皖药制字Z20100005）是安徽省芜湖市中医医院（以下简称“我院”）专家经验方，主要由当归、川芎、丹参、地龙、蜈蚣、全蝎、土鳖虫、水蛭等多味中药组成。具有活血化瘀、通络止痛的功效，经过老中医多年的临床验证，其疗效可靠。主要用于治疗瘀血阻滞所致的缺血性股骨头坏死，骨折后疼痛，活动不利、骨不愈合等症[1-8]。原有的高效液相色谱法含量测定标准仅以丹酚酸B 定量控制五虫化瘀通络胶囊的质量，测定指标较单一。为了更好地进行质量控制，需要制订更加合理的含量测定方法，本研究通过高效液相色谱法同时测定五虫化瘀通络胶囊中阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 3 种指标成分[9-10]，用于监控五虫化瘀通络胶囊的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（美国Agilent 公司，型号：Agi lent 1200 型）；万分之一电子天平（Mettler 公司，型号：XP-205）；数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500DB）；数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号：GZX-9140MBE）。

1.2 试药

阿魏酸对照品（批号：110773-201614，纯度99.0%），丹酚酸B 对照品（批号：111562-201716，纯度94.1%），丹参酮ⅡA 对照品（批号：110766-201721，纯度99.5%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈（TEDIA Company，色谱级）；甲醇（TEDIA Company，色谱级）；磷酸（上海展云化工有限公司，色谱级）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）为流动相，进行梯度洗脱（0～8 min，22%A；9～19 min，26%A；20～34 min，80%A；35～40 min，22%A）；柱温：20℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：0～21 min 为286 nm（检测阿魏酸和丹酚酸B），21～40 min 为270 nm（检测丹参酮ⅡA）；进样量10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品、丹酚酸B 对照品和丹参酮ⅡA 对照品适量，加入甲醇制成浓度分别是10.56、219.06、6.52 μg/ml 的混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液3 ml，同时放于10 ml 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成含阿魏酸3.17 μg/ml、丹酚酸B 65.72 μg/ml 和丹参酮ⅡA 1.96 μg/ml 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取五虫化瘀通络胶囊（批号：201110）20 粒，倒出内容物，混合，研细，精密称量约0.5 g，置于刻度为150 ml 的具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 ml，盖上玻璃塞，用封口膜封紧，称定其重量，置超声仪（350 W，40 kHz）中超声处理30 min，放冷至室温，称定其重量，再用75%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方配比称取除当归、川芎和丹参饮片以外的其他饮片，按照五虫化瘀通络胶囊制备工艺及供试品溶液的制备方法配制成缺味当归、川芎和丹参的阴性样品溶液。

2.3 方法专属性考察

精密吸取上述3 种溶液各10 μl，依法测定。结果显示阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 与样品中其他组分的分离度良好，阴性样品色谱峰在相应位置未检出，其专属性良好。见图1。

图1 五虫化瘀通络胶囊色谱图

2.4 线性关系考察

取混合对照品储备溶液，精密吸取5 ml，同时放于10 ml 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成含阿魏酸5.28 μg/ml、丹酚酸B 109.53 μg/ml 和丹参酮ⅡA 3.26 μg/ml 的混合对照品溶液，各精密吸取1、2、4、6、8、10 μl，分别进样测定，以样品浓度为横坐标（X），色谱峰的出峰面积为纵坐标（Y），进行曲线拟合。得到阿魏酸的回归方程为Y=44.592X-1.6293，R2=0.9999，表明在0.528～5.280 μg/ml 范围内，阿魏酸对照品线性关系良好。得到丹酚酸B 的回归方程为Y=11.421X+14.434，R2=0.9996，表明在10.953～109.530 μg/ml 范围内，丹酚酸B 对照品线性关系良好。得到丹参酮ⅡA 的回归方程为Y=63.063X-3.8696，R2=0.9994，表明在0.326～3.260 μg/ml 范围内，丹参酮ⅡA 对照品线性关系良好。

2.5 精密度试验

连续进样上述混合对照品溶液6 次，每次10 μl，分别记录阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 的峰面积，计算得阿魏酸峰面积的RSD 为0.58%，丹酚酸B 峰面积的RSD 为0.64%，丹参酮ⅡA 峰面积的RSD 为0.78%。

2.6 重复性试验

取同一批五虫化瘀通络胶囊（批号：201110），按“2.2.2”项下方法，精密称定后分别配制成6 份供试品溶液，再精密吸取各10 μl 的混合对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，分别测定。计算得阿魏酸含量的RSD 为1.77%；丹酚酸B 含量的RSD 为0.88%；丹参酮ⅡA 含量的RSD 为0.91%。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液，精密吸取10 μl，在配制好后的第0、2、4、6、8、10 h 分别进样1 次，测得峰面积积分值。计算阿魏酸峰面积的RSD 为0.41%，丹酚酸B 峰面积的RSD 为0.21%，丹参酮ⅡA 峰面积的RSD 为0.38%，结果显示供试品溶液测定在10 h内稳定性良好。

2.8 加样回收试验

采取加样回收法，取已知含量的五虫化瘀通络胶囊内容物（批号：201110）9 份，每份约0.25 g，精密称定，分别放于50 ml 的容量瓶中，分别精密加阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 对照品适量，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定胶囊含量并计算加样回收率。见表1。

表1 阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 加样回收试验结果

2.9 样品含量测定

分别精密称量201110、201119、201126 三批五虫化瘀通络胶囊样品各约0.5 g，依照五虫化瘀通络胶囊含量测定法进行测定，计算样品中阿魏酸、丹酚酸B和丹参酮ⅡA 含量。见表2。

表2 三批样品含量测定结果（mg/g）

3 讨论

五虫化瘀通络胶囊是中药复方制剂，由多味中药组成，疗效确切，为了更好地控制院内制剂的质量，需要对我院制剂的质量标准进行提高和完善。当归、川芎药材中所含的阿魏酸成分，具有活血行气、祛风止痛的功效，现代药理显示其具有抗血小板聚集、缓解血管痉挛等作用[11-14]。丹参的主要药效成分丹酚酸B，具有活血祛瘀、通经活络、凉血消肿的功效[15-16]。丹参酮ⅡA 具有保护血管内皮、改善微循环、抗炎、抗感染等多种药理作用，可以减轻炎症反应，提高机体免疫能力[17-18]。故本研究选择了阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 3 种活性成分进行含量测定。

参考相关文献报道及《中华人民共和国药典》，确定了阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 的最大吸收波长分别为286、321、270 nm，结合丹参是本制剂品种的君药成分，故仅选取286、270 nm 作为检测波长[19-22]。高效液相色谱法测定中药制剂中的阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 常采用乙腈-磷酸水、乙腈-甲酸水等流动相进行检测[23-26]，因此，本研究考察了乙腈、磷酸水、甲酸水几个不同组合，经过比对选取乙腈-0.1%磷酸作为流动相进行梯度洗脱。

本研究通过高效液相色谱法同时测定五虫化瘀通络胶囊中阿魏酸、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 3 种指标成分，结果表明该方法稳定可靠、灵敏度高，可用于五虫化瘀通络胶囊的质量控制。