微小RNA-195对结直肠癌细胞上皮-间质转化及侵袭的影响

刘 宁，马洪芳，杨文浩

（开滦总医院1肿瘤科，2外科，3风湿免疫科，河北 唐山 063000）

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病隐匿，且易发生早期转移，5 年生存率不佳[1]。上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞在特定生理、病理情况下转化为间质细胞的现象，被认为是肿瘤转移、侵袭的起始步骤，与恶性肿瘤进程密切相关[2]。近年来多项研究显示，微小RNA（microRNA，miR）参与调控多种恶性肿瘤细胞如结肠癌的增殖、侵袭及迁移等过程[3-5]。miR-195在前列腺癌、胃癌、结肠癌的肿瘤组织或细胞系中表达异常降低，通常作为抑癌基因发挥作用[6-8]。本研究通过体外细胞实验，研究miR-195对结直肠癌细胞EMT 及侵袭的影响，并探讨相关机制，以期为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料正常肠上皮细胞系NCM460、结直肠癌细胞系HCT116，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。miR-195 mimic、NC mimic，由弗元（上海）生物科技有限公司构建。Toll 样受体4/核转录因子κB（toll like receptor 4/nuclear transcription factor κB，TLR4/NFκB）信号 通路 激活 剂 脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS），上海研谨生物科技有限公司。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）试剂盒，上海信裕生物科技有限公司。兔抗人波形蛋白（Vimentin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、TLR4、髓样细胞分化因子88（my‑eloid differentiation factor 88，MyD88）、p50、p65 一抗，购自美国Abcam公司。

Transwell 小室，购自北京优尼康生物科技有限公司。紫外分光光度计，上海谱元仪器有限公司。TURE script One Step qRT-PCR 仪，购自北京百奥莱博科技有限公司。CheniDoc Touch 成像分析系统购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NCM460、HCT116 细胞分别培养于1640 培养基、DEME 培养基中，在培养基中补充100 mg/L 链霉素、100 U/mL 青霉素、10% 胎牛血清，标准条件（5% CO2、37 ℃、饱和湿度）。观察到细胞融合度>80% 左右时，0.25% 胰蛋白酶消化、传代，取对数期细胞用于后续实验。

1.2.2 qRT-PCR 检测 miR-195 表达量取对数期NCM460、HCT116 细胞，Trizol 法提取总RNA，紫外分光光度计测定浓度、纯度后逆转录获取cDNA，定量后按照试剂盒说明书要求设定反应体系：总体积20.0 µL，SYBR Premix Ex Taq II 11.5 µL，上、下游引物（10.0 µmol/L）各0.5 µL，DNA 模板1.5 µL，加入DD H2O 补足20.0 µL；90 ℃预变性6 min；95 ℃变性15 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，重复42个循环。以U6为内参基因，2-△△CT为目的基因相对表达强度，实验所用引物：miR-195：Forward primer：5'-TGCATGTC‑GTGTGCACGTTGCACG-3'；Reverse primer：5'-CTC‑GTGCACGCCATGTGCGTGTGC-3'；U6 snRNA：For‑ward primer：5'-AGCTTGTAAGCGTGTGTGCAACAC-3'；Reverse primer：5'-GTGACGTCACACGGCCGTG‑CACAC-3'。实验重复3次取均值。

1.2.3 细胞转染 取对数期HCT116细胞，接种至6孔板（1×105个/mL），当细胞再次融合达70% 左右时，随机分 为Control 组、NC 组、miR-195 mimic 组、miR-195 mimic＋LPS 组，Control 组不作处理，miR-195 mimic 组、NC 组按照LipofactamineTM2000 试剂盒说明书转染miR-195 mimic、NC mimic，miR-195 mimic＋LPS 组转染miR-195 mimic，并加入LPS 使其浓度为100 µg/mL。每组设置5 个复孔，培养至48 h 用于后续实验。

1.2.4 qRT-PCR 检测 miR-195 表达量取各组培养至48 h的细胞，同1.2.2项提取总RNA、获取cDNA、设定反应体系、设定反应条件、设计引物序列。以U6为内参基因，2-△△CT为目的基因相对表达强度计算miR-195表达量。实验重复3次取均值。

1.2.5 Transwell 实验观察侵袭能力 取Transwell 杯状小室，杯底滤膜预先均匀涂布Matrigel 胶（1:6 稀释），放置在24 孔板中。上层小室中加入各组细胞悬液200 µL（密度2.0×105个/mL），下层小室中加入RPMI 1640 培养基0.6 mL（含10% 胎牛血清）。培养24 h 至Matrigel 胶被降解。取出小室，PBS 冲洗，0.25 %戊二醛固定15 min，0.1% 结晶紫避光染色30 min，无菌棉签擦去上层小室细胞，洗涤、晾干。显微镜下计数穿膜细胞数量，随机选取10个视野，计算每个视野平均数。实验重复3次取均值。

1.2.6 划痕试验观察迁移能力 取各组培养至48 h的细胞。胰蛋白酶消化，重悬，调整密度至1×104个/mL，接种至6 孔板，孵育过夜，细胞再次融合，弃去培养基；在培养板底部用20 µL 移液器枪头划痕，更换为完全培养基，继续培养24 h，显微镜拍照，计算迁移率。迁移率（%）=（初始划痕宽度－24 h 后划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.2.7 Western blot 法检测细胞Vimentin、E-cadherin蛋白表达量 取各组培养至48 h 的细胞，预冷RIPA细胞裂解液冰上裂解，离心后提取全蛋白，经二喹啉甲酸试剂盒定量。取30 µg 待测样本，恒压下经12%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，湿转至膜，封闭液室温封闭2 h，洗涤，加入1:500稀释的兔抗人Vi‑mentin、E-cadherin 一抗，4 ℃孵育过夜，加入1:2 000稀释的山羊抗兔IgG 二抗，常温孵育2 h，洗涤。加入发光液，暗室中显影、定影，凝胶成像系统扫描分析，目的蛋白相对表达量以条带/GAPDH 条带灰度值表示。实验重复3次取均值。

1.2.8 双荧光素酶实验验证miR-195 与TLR4 的靶向关系 采用生物信息学软件miRanda、TargetScan初步预测，含有miR-195 结合位点的TLR4 mRNA 3'UTR，由上海位点生物科技有限公司对其进行鉴定与扩增。采用T4 DNA 连接酶将TLR4 mRNA 3'UTR 与线性化改良的双荧光素酶报告载体（pmir-RB-RE‑PORTTM）相连，构建TLR4 双荧光素酶报告载体，命名为pmir-RB-REPORTTM-TLR4-3'-UTR。 将pmir-RB-REPORTTM、 pmir-RB-REPORTTM-TLR4-3'-UTR、miRNA-195质粒（miR-195 mimic、NC mimic）共转染至293T 细胞，形成6 个转染组：pmir-RB-RE‑PORTTM组、pmir-RB-REPORTTM＋NC mimic 组、pmir-RB-REPORTTM＋miR-195 mimic 组、pmir-RB-RE‑PORTTM-TLR4-3'-UTR 组、pmir-RB-REPORTTMTLR4-3'-UTR＋NC mimic 组、pmir-RB-REPORTTMTLR4-3'-UTR＋miR-195 mimic组。孵育48 h后PBS清洗，裂解20 min 后检测荧光素酶强度，按照荧光素酶试剂盒说明书要求进行操作，并计算相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.2.9 Western blot 法检测细胞TLR4、MyD88、NFκB p65、p-NF-κB p65 蛋白表达量 取各组培养至48 h 的细胞，采用细胞核与细胞质蛋白提取试剂盒分别提取细胞核与细胞质蛋白，BCA 试剂盒定量。分别取30 µg 细胞核蛋白、细胞质蛋白，细胞核蛋白检测p50、p65 蛋白表达量，细胞质蛋白检测TLR4、MyD88蛋白表达量。恒压下经12% SDS 聚丙烯酰氨凝胶电泳，湿转至膜，封闭液室温封闭2 h，洗涤，加入稀释度为1:500 的兔抗人TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NFκB p65 一抗，4℃摇床孵育过夜，洗涤，加入稀释度为1:2 000 山羊抗兔二抗，常温孵育2 h，洗涤。加入发光液，暗室中显影、定影，凝胶成像系统扫描分析，目的蛋白相对表达量以条带/GAPDH 条带灰度值表示。实验重复3次取均值。

1.3 统计学处理采用IBM SPSS 21.0 软件处理、分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本计量资料采用单因素方差分析，以LSD-t检验分析两两样本。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同细胞系中miR-195 表达量比较正常肠上皮细胞系NCM460、结直肠癌细胞系HCT116 中miR-195 表 达 量 分 别 为（0.85±0.09）、（0.26±0.03），与NCM460 细胞系比较，HCT116 系中miR-195 表达量显著降低（P<0.05）。见图1。

图1 qRT-PCR检测NCM460、HCT116细胞系中miR-195和内参U6的扩增曲线

2.2 各组miR-195 表达量比较Control 组、NC 组、miR-195 mimic 组、miR-195 mimic＋LPS 组miR-195表 达 量 分 别 为（0.27±0.04）、（0.26±0.05）、（1.36±0.21）、（0.92±0.10），与Control 组、NC 组比较，miR-195 mimic 组miR-195 表达量显著升高，与miR-195 mimic 组比较，miR-195 mimic＋LPS 组miR-195 表达量显著降低（P<0.05）。见图2。

图2 qRT-PCR检测4组细胞中miR-195、内参U6的扩增曲线

2.3 各组侵袭能力比较 Control 组、NC 组、miR-195 mimic 组、miR-195 mimic＋LPS 组每个视野平均穿膜细胞数量分别为（125.40±17.33）、（123.60±18.92）、（32.00±7.61）、（68.40±10.92）个，与Control 组、NC 组比较，miR-195 mimic 组每个视野平均穿膜细胞数量显著减少（P<0.05）；与miR-195 mimic 组比较，miR-195 mimic＋LPS 组每个视野平均穿膜细胞数量显著增加（P<0.05）。见图3。

图3 miR-195 mimic转染后各组穿膜细胞数比较（×200，标尺50 μm）

2.4 各组迁移能力比较Control 组、NC 组、miR-195 mimic 组、miR-195 mimic＋LPS 组细胞迁移率分别为（75.21±8.33）% 、（76.30±8.19）% 、（45.23±6.70）% 、（59.25±6.81）%，与Control 组、NC 组比较，miR-195 mimic 组迁移率显著降低（P<0.05）；与miR-195 mim‑ic 组比较，miR-195 mimic＋LPS 组迁移率显著升高（P<0.05）。见图4。

图4 miR-195 mimic转染后各组迁移率比较（×100，标尺25 μm）

2.5 各组细胞Vimentin、E-cadherin 蛋白表达量比较与Control 组、NC 组比较，miR-195 mimic 组Vi‑mentin 蛋白表达量显著降低（P<0.05），E-cadherin 蛋白表达量显著升高（P<0.05）；与miR-195 mimic 组比较，miR-195 mimic＋LPS 组Vimentin 蛋白表达量显著升高（P<0.05），E-cadherin 蛋白表达量显著降低（P<0.05）；Control 组、NC 组Vimentin、E-cadherin蛋白表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1 和图5。

图5 各组细胞Vimentin、E-cadherin蛋白表达量

表1 各组细胞Vimentin、E-cadherin蛋白表达量比较（-x±s，n=5）

2.6 双荧光素酶实验结果双荧光素酶结果显示，与仅转染pmir-RB-REPORTTM的293T 细胞比较，共转染pmir-RB-REPORTTM-TLR4-3'-UTR 与miR-195 mimic 的293T 细胞荧光素酶活性值显著升高（P<0.05）。可知TLR4 是miR-195 的一个靶基因，两者结合位点为TLR4 的3'-UTR 片段（结合位点为HasmiR-195 序 列3'-AUCGGACGUGUACGCACGCGA‑CUC-5' 中CGCGACUC 与TLR4 3'-UTR 序 列5'-ACUGCACGCCAAACGCCGCGCUGAG-3' 中 GC‑GCUGAG）。见图6。

图6 双荧光素酶实验结果

2.7 TLR4、MyD88 蛋白表达 量、p-NF- κB p65/NF-κB p65 比较与Control 组、NC 组比较，miR-195 mimic 组TLR4、MyD88 蛋 白 表 达 量、p-NF- κB p65/NF-κB p65 显著降低（P<0.05）；与miR-195 mim‑ic组比较，miR-195 mimic＋LPS组TLR4、MyD88蛋白表 达 量、p-NF- κB p65/NF- κB p65 显 著 升 高（P<0.05）；Control 组、NC 组TLR4、MyD88 蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65 比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图7。

图7 miR-195 mimic转染后各组TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达比较

3 讨论

结直肠癌是起源自肠上皮组织的恶性肿瘤，研究认为家族史、高脂饮食、低纤维饮食、高血压史、糖尿病史等均是其发生的风险因素[9]。目前手术切除及放化疗等是临床干预结肠癌的常用方式，但因患者在确诊时已进入中晚期，干预效果并不理想。研究显示，肿瘤转移是结肠癌患者的主要死因，15%~25% 的患者在确诊前已发生肝转移，且>50% 的患者发生浸润及转移[10]。EMT是肿瘤细胞的重要特征，其异常激活将导致恶性肿瘤形成及发展。因此，抑制EMT 过程对于改善结肠癌预后至关重要。随着基础研究的逐渐深入，基因治疗为结肠癌治疗提供了新的希望。

在肿瘤生长、发展的过程中，EMT 主要包括细胞极性变化、细胞间丧失黏附、细胞外基质与肿瘤基底膜被破坏，进而获取高侵袭、迁移能力，表现为间质细胞标志物如Vimentin表达增加，上皮细胞标志物如E-cadherin 表达降低[11]。本研究结果显示，结直肠癌细胞系HCT116 中miR-195 表达量显著低于正常肠上皮细胞系NCM460；通过转染方式上调HCT116 中miR-195 表达量后，每个视野平均穿膜细胞数量减少、迁移率降低，Vimentin 蛋白表达量降低，E-cad‑herin 蛋白表达量升高，提示miR-195 在结肠癌细胞中低表达，且上调其表达可抑制结肠癌细胞EMT 及侵袭。miRNA 是调节基因表达的重要因子，且其表达模式与肿瘤起源关系密切，而且可能参与肿瘤分化[12]。miR-195 位于染色体17p13.1 上，该部位在肿瘤发展过程中易缺失，在肿瘤研究中其被认为是抑癌基因[13]。Song 等[14]研究发现，miR-195 水平与胃癌癌症标志物水平呈负相关，且在诊断及预测其化疗效果上具有重要价值。施能等[15]采用miR-195 模拟物转染舌鳞癌CAL27 细胞系，结果发现miR-195 的过表达可显著抑制细胞活力，低表达则表现出相反效果，与本研究结果均提示过表达miR-195具有显著的抗癌细胞作用。

TLR4是一种重要的固有免疫分子及跨膜模式识别受体，其可识别包括LPS 在内的外源性配体，并通过在慢性炎症反应过程中创造肿瘤微环境，参与调控肿瘤发生与发展。TLR4识别外源性配体或内源分子后，将识别信号传递给MyD88，诱导NF-κB 转入细胞核并发生磷酸化，从而激活下游相关基因转录过程，激活巨噬细胞、单核细胞等合成及分泌白介素-6（IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症介质，引发一系列炎症反应[16]。研究指出，通过减轻炎症反应，抑制TLR4/NF-κB 信号传导，可有效降低癌症标志物水平，抑制DNA 损伤及癌症干细胞的增殖、去分化，提示该通路在结直肠癌中的作用[17]。本研究采用双荧光素酶实验验证miR-195 与TLR4 的靶向关系，结果表明两者存在靶向关系；与Control 组、NC组比较，miR-195 mimic组TLR4、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65 显著降低，且增用TLR4/NF-κB信号通路激活剂LPS后，过表达miR-195对结直肠癌细胞EMT 及侵袭的抑制作用有所减弱，提示miR-195 可能通过靶向抑制TLR4/NF-κB 信号通路，发挥对结直肠癌细胞的作用。

综上所述，过表达miR-195 可通过靶向抑制TLR4/NF-κB 信号通路，发挥对结直肠癌细胞EMT 及侵袭的抑制作用。关于miR-195 是否存在其他作用靶点，仍有待深入研究。