AR-V7对前列腺癌细胞增长及Akt/mTOR信号通路的影响

艾孜麦提·阿不都热合曼, 马东升, 安恒庆，2

（新疆医科大学1第一附属医院泌尿外科, 2公共卫生与预防医学博士后流动站,乌鲁木齐 830011）

前列腺癌(prostate cancer，PCA)是男性泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤，按世界卫生组织（world health organization，WHO）2018年全球癌症统计，在世界范围内，其发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二位，仅次于肺癌[1]。我国PCA 的发病率和死亡率近年来呈现明显上升趋势[2]。雄激素受体(androgen re‑ceptor, AR)在PCA 的发生、发展及转移中起重要作用，前列腺中主要的雄激素是双氢睾酮，与胞质内AR结合后，促进类固醇-受体复合物进入核内，激活雄激素反应元件（androgen response elements，ARE），调控靶基因的转录表达。正常情况下AR 信号通路促进前列腺上皮细胞的分化，而异常的信号通路则会调节细胞周期、存活、增殖, 从而使得肿瘤恶化[3]。雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy，ADT)是PCA 患者中首先的治疗方案，但经过中位时间18~24个月的内分泌治疗后，几乎所有患者都进展为去势抵抗型PCA(castration resistant prostate cancer，CRPC)[4]。CRPC 其调控机制和作用机制尚未完全阐明，不过已有研究结果提示AR 信号持续激活是CRPC 发生发展的重要原因，其中AR-V7是AR信号通路在低雄激素水平的环境中能被激活的原因之一[5-6]。磷脂酰肌醇3 激酶/丝氨酸苏氨酸激酶/雷帕霉素激酶（PI3k/AKT/mTOR）信号通路对疾病发病有着重要作用，PCA 细胞中发现PI3k/AKT 信号通路经常被异常激活，并已被证明在CRPC 进展中发挥重要作用[7-9]。AR 和Akt/mTOR 通路的相互反馈激活已被证实，癌细胞在其中一个途径被药物抑制时适应另一个途径生存[10-11]。本研究将pIRES2-EGFP-AR-V7 接种于PC-3 细胞，验证AR-V7 的表达情况，随后检测Akt、mTOR、p-AKT、p-mTOR 的蛋白和基因水平，探讨AR-V7 与Akt/mTOR 通路之间的相互作用，为CRPC的机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂PC-3 细胞来源于丰辉生物，胎牛血清(FBS)(Excell Bio 公司)，Lipofectamine 3000® Transfection Reagent(Invitrogen 公司)，pIRES2-EGFP 空载质粒(新疆昆泰锐生物公司)，SmaI 内切酶、PmlI 内切酶（NEB 公司），T4 DNA Ligase(takara 公司)，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、pEASY®-T1Cloning Kit、CCK-8 细胞增殖/毒性检测试剂盒(全式金生物公司),AnnexinVPE/7AAD Kit(BD公 司), TRIzol ™Reagen(ambion 公 司), Akt(pan)(C67E)RabbitmAb, Phospho-Akt(Ser473)Antibody, mTOR(7C10)RabbitmA(CST 公司)，Real Time PCR instrument(ABI公司)。

1.2 细胞培养PC-3 细胞用含1% 青-链霉素、10%胎牛血清的F-12K 培养基、在含5% 的CO2和饱和湿度37℃的培养箱中培养，将处在生长状态下的细胞进行传代。

1.3 pIRES2-EGFP-AR-V7 重组质粒构建和细胞转染使用全基因化学合成的方法合成AR-V7 CDS区序列，连接到pIRES2-EGFP 表达质粒载体上，取处于对数生长期的PC-3 细胞，按Lipofectamine3000 转染试剂说明书分别将pIRES2-EGFP 空载质粒及pIRES2-EGFP-AR-V7 重组载体传染PC-3 细胞，并且为后续实验确定最佳转染条件。

1.4 实验分组AR-V7 重组载体组（pIRES2-EGFPAR-V7 过表达载体质粒传染PC-3 细胞，转染试剂浓度0.75 µL/mL，转染时间48 h），空载对照组（pIRES2-EGFP 空载质粒传染PC-3 细胞，转染试剂浓度0.75µL/mL，转染时间48 h），空白对照组（正常培养48 h）。

1.5 CCK8 检测细胞增殖取生长状态良好汇合率达90% 的PC-3 细胞，按照1.4 实验分组进行转染，每组5重复。干预完成后，弃去培养基，每孔加入10 µL配置好的10% CCK-8 溶液，继续在培养箱中孵育，2 h后用酶标仪测定450 nm处的OD值。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取生长状态良好汇合率达90% 的PC-3 细胞，按1.4 实验分组干预细胞，将每组细胞瓶内的培养液吸出至离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞），PBS 洗涤贴壁细胞2 次，将PBS 一并收集至离心管内，胰酶消化细胞，将细胞转移到离心管内，1000 r/min 离心5 min，弃上清。用预冷的PBS 洗涤2 遍，弃上清。加入500 µL 1×Binding Buffer 重悬细胞，过200 目筛网，制成单细胞悬液。每管加入5 µL Annexin V-PE 和10 µL 7-AAD，轻轻混匀，4℃避光放置5 min。在30 min 内进行流式细胞仪检测。

1.7 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测AKT、mTOR 基因表达按1.4实验分组干预完成后，弃去每组细胞瓶中的培养基，加入1 mL Trizol 消化细胞，使Trizol 平铺在细胞层面上，反复摇晃细胞培养瓶，装入1.5 mL EP管中。后续实验按照qRT-PCR实验报告操作。

1.8 蛋白免疫印迹法（western blot，WB）检测AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 蛋白表达按1.4 实验分组干预完成后，弃去每组细胞瓶中的培养基，加入3 mL 无菌的PBS 缓冲液反 复 冲 洗2 遍，弃去PBS 缓冲液，用胰酶消化细胞。离心后弃去上清留细胞沉淀，用5 mL 无菌PBS 洗1 遍后收集细胞。后续实验按照WB实验报告操作。

1.9 统计学分析用SPSS 24.0软件进行分析。符合正态性、方差齐的计量资料采用均数±标准差做统计描述，多组比较采用单因素方法分析，两两比较用SNK-q检验，计数资料用百分比形式进行统计描述，两组比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 验证3组AR-V7基因及蛋白表达水平AR-V7基因过表达后AR-V7 mRNA 在AR-V7 重组载体组中的表达水平（11.740±1.968）明显高于空白对照组（1.003±0.090)、空载对照组（1.121±0.125），差异均有统计学意义（P<0.05），AR-V7 的蛋白表达水平在AR-V7重组载体组中的表达水平（0.722±0.043）明显高于空白对照组（0.283±0.161）、空载对照组（0.219±0.084），差异均有统计学意义（P<0.05），见图1、2。

图1 3组AR-V7 mRNA表达量图

图2 3组WB实验条带图及柱状图

2.2 3组细胞增殖活性比较PC-3细胞在AR-V7重组载体组中的增殖活性（OD=0.967±0.037）明显高于 空 白 对 照 组（OD=0.981±0.049）、空 载 对 照 组（OD=0.967±0.037），差 异 均 有 统 计 学 意 义（P<0.05），见图3。

图3 3组细胞增殖柱状图

2.3 3 组细胞凋亡率比较空白对照组、空载对照组、AR-V7 重组载体组细胞凋亡率分别为（6.103±0.870）%、（6.320±0.949）%、（5.000±0.881）%，各组间差异均无统计学意义（P>0.05），见图4。

图4 3组细胞凋亡流式图

2.4 Akt、mTOR 基因表达水平Akt 基因表达水平在各组间差异无统计学意义（P>0.05），mTOR 基因表达水平在各组间差异无统计学意义（P>0.05），见表1、图5。

图5 各组AKT和mTOR基因表达柱状图

表1 PC-3细胞中各基因表达水平分析（±s）

表1 PC-3细胞中各基因表达水平分析（±s）

分组空白对照组空载对照组AR-V7重组载体组AKT 1.019±0.231 0.987±0.127 1.333±0.211 mTOR 1.017±0.219 1.064±0.108 1.389±0.507

2.5 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白表达水平p-Akt 和p-mTOR 蛋白在AR-V7 重组载体组中的表达水平明显低于两个对照组（P<0.05）。各组Akt及mTOR蛋白表达水平无显著差异（P>0.05），见表2、图6。

图6 PC-3细胞中各蛋白表达水平的柱状图

表2 PC-3细胞中各蛋白的表达水平分析（±s）

表2 PC-3细胞中各蛋白的表达水平分析（±s）

注：与空白对照组相比，△P<0.05；与空载对照组相比，▲P<0.05。

分组空白对照组空载对照组AR-V7重组载体组AKT 0.702±0.024 0.670±0.034 0.685±0.029 p-AKT 0.833±0.099 0.850±0.045 0.529±0.071△▲mTOR 0.595±0.046 0.579±0.027 0.580±0.031 p-mTOR 0.581±0.024 0.561±0.046 0.297±0.021△▲

3 讨论

PCA 初诊时多数已属中晚期。内分泌治疗是中晚期PCA 患者的基础治疗，但最后绝大部分患者仍然无法避免药物抵抗的事实，从而进入CRPC 阶段，常规的内分泌治疗往往对这些患者病情的改善并无太大的作用[12]。CRPC 的机制目前尚不明确，相关分子网络较为复杂，多条信号通路协同参与，同时随疾病的进展而变化，已有研究表明，在CRPC 阶段中AR信号持续激活促进PCa 细胞的存活，其中AR 通路被激活的原因包括AR 基因的突变、扩增、剪接突变体产生、蛋白分子伴侣改变以及AR 与其他相互通路的串扰等[13-14]。

本研究结果显示：AR-V7 重组载体细胞的增殖活性显著升高，提示AR-V7 可以促进PCa 细胞的增殖。与文献［15］结论一致。Bryce 等[16]发现了PCA 通过激素治疗后AR-V7 的阳性率和表达强度明显升高，其中阿比特龙治疗后约55% 的患者可检测到AR-V7，苯那鲁胺治疗后AR-V7 的表达可从15% 增加到50%。研究者对AR-V7 进行qRT-PCR 检测发现，与普通PCA 相比，CRPC 的AR-V7 表达水平明显升高[17]。有研究将PCA 根治术后患者根据AR-V7 表达水平教中位数水平的高低进行了分组，随访数据显示，与AR-V7水平高于中位数的患者相比，AR-V7水平低于中位数患者的无进展生存率明显更高[18]。提示，在阻断雄激素的状况下，AR-V7 可独立激活下游通路，能使AR 信号通路处于激活状态，促使肿瘤生长，最终导致患者进入去势抵抗状态，使疾病进一步进展，预后更差。

本研究结果表明：pIRES2-EGFP-AR-V7 重组载体组p-Akt、p-mTOR 蛋白表达水平显著降低，但是AKT 和mTOR 的基因表达在各组细胞中没有显著差异，说明AR-V7 抑制了AKT 和mTOR 的被磷酸化。AKT 是PI3K 的重要下游靶激酶，AKT 被磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(phosphoinositide dependent protein kinase-1,PDK1)磷酸化而活化形成p-Akt，后者可以介导下游信号传导，mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K/Akt 信号通靶点，p-mTOR 由Akt 磷酸化mTOR 形成的，可以促进细胞代谢、生长增殖及存活等生理活动[19-20]。值得注意的是，在许多实验中确认了PI3K 与AR 通路的串扰是CRPC 发生的另外一种机制[21]。本研究结果显示：AR-V7 抑制了AKT 和mTOR 的磷酸化，说明AR-V7 与PI3K/AKT 之间存在一定的相互作用，但是AR-V7 是具体怎么调节PI3K/AKT信号通路的磷酸化，这需要今后进一步研究。

综上所述，AR-V7 基因对PCA 细胞的生长有促进作用，同时AR-V7抑制了p-Akt及p-mTOR蛋白表达，为CRPC的靶向治疗指出了新的方向。