沉默NRF2基因表达及鸦胆子苦醇均可抑制人胆管癌RBE细胞增殖

潘若谷，李可为

胆管癌是一种起源于胆管上皮的恶性肿瘤，具有发病隐袭、进展迅速、恶性程度高的特点。据美国癌症协会的统计，胆管癌患者的5年生存率只有8%～10%。大部分经临床诊断的胆管癌患者均已处于中晚期，已失去了根治性手术切除的机会[1]，并且胆管癌还具有明显的耐药特征[2]。因此，探究胆管癌快速增殖背后的具体机制以及寻找潜在的治疗靶点具有重要的科研和临床意义。

NRF2是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，广泛参与机体的生理和病理过程[3]。众多的研究指出，NRF2在包括肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌和宫颈癌等众多恶性肿瘤的转移、侵袭和增殖等过程中都发挥着十分重要的作用[4-8]。然而，纵观近10年的研究，鲜有关于NRF2在胆管癌增殖中作用的相关报道。本研究旨在检测NRF2在正常人体胆道组织和胆管癌组织中NRF2表达水平的差异，并通过siRNA沉默NRF2在人胆管癌细胞株RBE中的表达水平，探讨NRF2表达对胆管癌细胞快速增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 数据库数据

通过UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu）检索正常人胆道组织和胆管癌组织中NRF2 mRNA的表达水平。

1.2 细胞、试剂及仪器

人胆管癌细胞株RBE由上海交通大学医学院附属仁济医院胆胰外科保存并传代，正常胆管上皮H69细胞由上海交通大学基础医学院生化系保存并传代。LipofectAMINE 2000和TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，tbGREEN实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，DMEM高糖培养液和胎牛血清购自上海源培生物科技股份有限公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，CCK-8检测试剂盒、DCFH-DA细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测探针试剂盒和鸦胆子苦醇试剂购自美国MCE公司，快速吉姆萨染色试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗人NRF2和β-actin多克隆抗体购自美国CST公司，辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG购自美国Sigma公司。

1.3 实时荧光定量PCR检测NRF2 mRNA的表达水平

分别将RBE细胞和正常胆管上皮H69细胞接种于直径为10 cm的细胞培养皿中，待细胞生长至60%～70%的融合度时收集细胞，采用TRIzol试剂提取细胞总RNA；随后用tbGREEN实时荧光定量PCR试剂检测各组细胞中NRF2 mRNA的表达水平；反应体积及PCR扩增流程按试剂盒说明书中提供的流程进行，分别以内照参β-actin及GAPDH基因的Ct值，计算目的基因NRF2 mRNA的相对表达量。NRF2基因上游引物序列为5’-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA-3’，下游引物序列为5’-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT-3’；GAPDH基因上游引物序列为5’-GG AGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；β-actin基因上游引物序列为5’-GGCATTC ACGAGACCACCTAC-3’，下游引物序列为5’-CGACATGACGTTGTTGGCATAC-3’。

1.4 蛋白质印迹法检测NRF2蛋白的表达水平

分别将RBE细胞和正常胆管上皮H69细胞接种于直径为10 cm的细胞培养皿中，待细胞生长至60%～70%融合度时收集细胞，加入RIPA裂解液，在裂解液中充分裂解细胞后提取细胞总蛋白，并通过BCA蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行检测。2组细胞各取30 μg蛋白样品进行上样，用分离胶浓度为10%的SDS-PAGE分离蛋白，随后将分离后的蛋白通过湿转法转移至PVDF膜上。PVDF膜于含5%脱脂牛奶的封闭液中封闭1 h后，加入一抗[兔抗人NRF2及β-actin多克隆抗体（体积稀释比例为1∶500）] 4 ℃孵育过夜，次日室温条件下加入二抗[辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（体积稀释比例为1∶1 000）]孵育1 h后，于凝胶成像仪下曝光显影。

1.5 脂质体转染

RBE细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中培养。当细胞生长至约70%融合度时，采用LipofectAMINE 2000将特异性针对NRF2基因的2条siRNA（siNRF2-1和siNRF2-2）及阴性对照（negative control，NC）siRNA（siNC）转入RBE细胞，转染流程按试剂盒相关说明。随后分别采用实时荧光定量PCR（实验流程同1.3节）和蛋白质印迹法（实验流程同1.4节）检测siRNA的沉默效率。siNRF2-1正义链序列为5’-AAGUUUUUUCUGUUUUUCCAG-3’，反义链序列为5’-GGAAAAACAGAAAAAACUU GA-3’；siNRF2-2正义链序列为5’-UCAUU UUCAAUAUUAAGACAC-3’，反义链序列为5’-GUCUUAAUAUUGAAAAUGACA-3’；siNC

正义链序列为5’-UCAACUUCUGUCAGUUUG GCU-3’，反义链序列为5’-CCAAACUGACAG AAGUUGACA-3’。

1.6 DCFH-DA法检测细胞内ROS的含量

取对数生长期的siNRF2-1组、siNRF2-2组和siNC组RBE细胞接种于96孔板中，待细胞生长至合适密度后，采用DCFH-DA试剂盒检测细胞内ROS的含量，实验流程按照试剂盒的操作说明进行。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期的siNRF2-1组、siNRF2-2组和siNC组RBE细胞，以2 000个/孔的密度接种于96孔板中。分别于24、48、72和96 h时，加入CCK-8试剂，在酶联免疫检测仪波长450 nm处检测各组细胞的D值，并计算相对生存活力表示细胞的增殖情况，具体检测流程参阅CCK-8试剂盒流程说明。

1.8 细胞克隆形成实验

收集生长至对数生长期的siNRF2-1组、siNRF2-2组和siNC组RBE细胞，以500个/孔的密度接种至96孔板中。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养细胞，7 d后更换新鲜培养液并继续培养7 d。14 d后，除去所有培养液，采用快速吉姆萨染色试剂盒进行克隆染色，具体流程按试剂盒操作说明。记录肉眼可见的克隆数（独立不连续的肉眼可见的克隆球）并进行统计分析。

1.9 鸦胆子苦醇对RBE细胞增殖的影响

取对数生长期的RBE细胞，以4×103个/孔的密度接种于96孔板中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中培养24 h。实验分为4组，siNRF2-1组、siNRF2-2组、siNC组和siNC＋鸦胆子苦醇组；siNC组RBE细胞培养24 h后除去培养液，加入鸦胆子苦醇（100 μL/孔）。分别于24、48、72和96 h时，采用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖情况，实验流程同1.7节。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism version 8.0统计学软件对所有的实验数据进行统计学分析。所有实验均独立重复3次，计量资料以表示。多组间比较采用多因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NRF2在胆管癌中高表达

通过在UALCAN数据库中检索并分析比对正常胆道组织（9例）和胆管癌组织（36例）中NRF2的表达情况。结果（图1A）显示，胆管癌组织组中NRF2的表达水平相较正常胆道组织组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测正常胆管上皮H69细胞和胆管癌RBE细胞中NRF2的表达情况。结果（图1B和图1C）显示，H69细胞中NRF2 mRNA和蛋白的表达水平均低于RBE细胞（P均＜0.01）。这一结果与数据库中检索获得的结果一致，提示胆管癌细胞确实具有高表达NRF2的特点。

2.2 采用siRNA沉默RBE细胞中NRF2的表达水平及对RBE细胞中ROS含量的影响

为了进一步探究NRF2对胆管癌的增殖能力是否具有重要的影响，本研究采用siRNA沉默RBE细胞中NRF2的表达水平。实时荧光定量PCR（图2A）和蛋白质印迹法（图2B）检测结果显示，siNRF2-1和siNRF2-2组RBE细胞中NRF2 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调（P均＜0.05）。这一结果提示，本研究中设计的2条siNRF2-1和siNRF2-2均能够有效沉默RBE细胞内NRF2基因的表达水平。

由于NRF2是氧化应激时参与调控基因转录和维持细胞内ROS水平稳定的重要转录因子[9]，因此细胞内的ROS水平会伴随NRF2表达水平的改变而发生改变。DCFH-DA法检测结果（图2C）显示，当敲低NRF2基因的表达水平后，2组RBE细胞内ROS水平均出现了明显回升（P＜0.05和P＜0.01）。这一结果进一步说明，有效敲低RBE细胞内NRF2的表达水平后能明显提高细胞内ROS的水平。

Fig.1 High expression of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) was observed in cholangiocarcinoma.A: The expression level of NRF2 mRNA in bile duct and cholangiocarcinoma was analyzed by UALCAN database.B: The expression level of NRF2 mRNA in normal bile duct epithelial H69 cells and cholangiocarcinoma RBE cells was detected by real-time fluorescent quantitative PCR (n=3).C: The expression levels of NRF2 protein in H69 cells and RBE cells was detected by Western blotting.*P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).图1 NRF2在胆管癌中高表达

2.3 NRF2是胆管癌细胞增殖的重要调节因素

在明确siRNA能够有效敲减RBE细胞内NRF2基因的表达水平后，本研究进一步对NRF2对胆管癌细胞的增殖能力是否产生重要的影响展开研究。CCK-8法检测结果（图3A）显示，伴随NRF2表达水平的下调（siNRF2-1和siNRF2-2组RBE细胞），胆管癌细胞的增殖能力出现了明显下降（P均＜0.01）。

进一步通过平板克隆形成实验检测发现，NRF2敲低的胆管癌细胞（siNRF2-1和siNRF2-2组RBE细胞）相较于对照组RBE细胞，其形成的克隆数量明显减少（图3B）。这一结果提示，沉默NRF2表达能抑制RBE细胞的增殖能力，NRF2确实对胆管癌的增殖产生了重要的影响。

2.4 鸦胆子苦醇能够有效抑制胆管癌细胞的增殖

鸦胆子苦醇是一类苦木内酯类化合物，能够通过靶向抑制NRF2的活性而发挥抗癌作用[12]。已有研究报道，鸦胆子苦醇能够抑制部分肿瘤的增殖[13]，但目前尚未有该药物应用于胆管癌治疗细胞的报道。因此，本研究进一步旨在对该药物是否基于抑制NRF2的表达从而发挥治疗胆管癌的效果展开探讨。

CCK-8法检测结果（图4A）显示，相较于siNC组，siNC＋鸦胆子苦醇组RBE细胞的增殖能力被明显抑制（P＜0.01）；但与siNRF2-1组和siNRF2-2组细胞相比，siNC＋鸦胆子苦醇组RBE细胞的活性差异无统计学意义；这一结果提示，鸦胆子苦醇能抑制RBE细胞的增殖。

Fig.2 Effect of silencing nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) gene in cholangiocarcinoma RBE cells by siRNA and the effect on reactive oxygen species (ROS) content in RBE cells.A: The expression level of NRF2 mRNA in RBE cells transfected with siRNA targeting NRF2 gene (siNRF2-1 and siNRF2-2) was detected by real-time quantitative PCR.B: The expression level of NRF2 protein in RBE cells transfected with siNRF2-1 and siNRF2-2 was detected by Western blotting.C: The ROS level in RBE cells transfected with siNRF2-1 and siNRF2-2 was detected by DC-FHDA method.RBE cells transfected with negative control siRNA (siNC) were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01 (n=3).图2 siRNA有效沉默胆管癌RBE细胞中NRF2基因的表达水平及对RBE细胞中ROS含量的影响

Fig.3 The proliferation of RBE cells with silencing of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) gene was detected by CCK-8 (A) and plate clone formation experiment (B),respectively.siNRF2-1 and siNRF2-2:RBE cells were transfected with siRNA targeting NRF2 gene (siNRF2-1 and siNRF2-2);RBE cells transfected with negative control siRNA (siNC) were taken as the control.**P＜0.01 (n=3).图3 分别采用CCK-8法（A）和平板克隆形成实验（B）检测沉默NRF2基因表达对胆管癌RBE细胞增殖能力的影响

实时荧光定量PCR法检测结果（图4B）显示，相较于siNC组，siNC＋鸦胆子苦醇组RBE细胞中NRF2 mRNA的表达水平明显下调（P＜0.01）。

进一步采用DCFH-DA法检测细胞内ROS的水平，结果（图4C）显示，相较于siNC组，siNC＋鸦胆子苦醇组RBE细胞中ROS的含量明显提高（P＜0.01）。这一结果提示，鸦胆子苦醇能有效提高RBE细胞内的ROS含量。综合上述结果，本研究认为鸦胆子苦醇能够通过抑制胆管癌细胞RBE内NRF2的表达水平从而发挥抑制胆管癌细胞增殖的效果。

Fig.4 Effects of brusatol on proliferation and reactive oxygen species (ROS) content of cholangiocarcinoma RBE cells.A: The proliferation of RBE cells was detected by CCK-8 method.B: The expression level of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) mRNA in RBE cells was detected by realtime fluorescent quantitative PCR.C: The restoration of cellular ROS was detected by DC-FHDA assay.siNC: RBE cells were transfected with negative control siRNA;siNRF2-1 and siNRF2-2: RBE cells were transfected with siRNA targeting NRF2 gene;siNC+brusatol: RBE cells were transfected with siNC combined with brusatol.**P＜0.01 (n=3).图4 鸦胆子苦醇对胆管癌RBE细胞增殖及ROS含量的影响

3 讨论

胆管癌是一类源自胆管上皮的恶性肿瘤，具有发病隐袭、恶性程度高、进展迅速的特点[1,12]。有研究显示，胆管癌的治疗主要包括手术治疗和化学药物治疗[13]，由于被临床诊断的患者大多处于中晚期和晚期且常伴有肝内转移从而失去了手术切除的机会，因此化学药物治疗成为了众多胆管癌患者的重要治疗方式之一[14]。然而，由于胆管癌的异质性极强，因此对以吉西他滨为一线治疗药物的化疗方案表现出了人群的耐药效应[15]。因此，阐明胆管癌增殖的重要调控因素并探索开发新的治疗策略对攻克胆管癌具有很重要的意义。

NRF2是一种氧化应激条件下起关键作用的转录因子，能够在受到ROS刺激时启动众多抗氧化反应元件（antioxidative response elements，ARE）的转录，从而发挥抵抗氧化应激的重要作用[16]。通常情况下，NRF2通过与KEAP1形成复合体并降解的形式而处于低表达状态[9]。既往的研究大量文献报道提示，包括肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌在内的众多类型肿瘤中都检测到了NRF2表达水平增高或被异常激活[3,17-19]，然而胆管癌中NRF2的表达是否发生改变却鲜有报道。本研究中发现，胆管癌中NRF2的表达水平与其他肿瘤出现了类似的升高现象，这意味着NRF2可能也在胆管癌中发挥着重要的作用。由于NRF2是细胞控制氧化还原平衡的重要环节，因此当肿瘤细胞中出现NRF2的表达水平增高时也通常会伴有细胞内ROS水平的显著降低。ROS作为一类性质极其活泼同时又广泛参与细胞生命活动的小分子物质同样会对相关基因的表达产生重要的影响[8,20]。本研究发现，在胆管癌RBE细胞内NRF2表达水平高表达的情况下，其细胞内ROS的含量明显减低，这与之前本课题组的推测是相符的。同时，大量的研究指出ROS能够对肝癌、胃癌和食管癌等恶性肿瘤的增殖产生抑制作用，由此推测降低细胞内ROS水平可能也对胆管癌细胞的增殖产生了一定的促进作用，由于本研究着眼于鸦胆子苦醇与NRF2之间的相互作用是否能够改善胆管癌的进展，因此并未对下降的细胞内ROS水平是否对胆管癌的增殖产生了影响进行探索，相关研究会在未来进一步予以完善。

鸦胆子苦醇是近年来新被发现的一种抗癌药物，因其能够靶向NRF2从而发挥抗肿瘤生长的作用[21]。ZHOU等[10]研究发现，鸦胆子苦醇能够有效抑制胰腺癌的进展、PARK等[22]则发现，鸦胆子苦醇能够强力抑制结肠癌的进展。本研究中发现，鸦胆子苦醇同样能够通过靶向抑制NRF2的表达从而抑制胆管癌的增殖并有效提高了胆管癌细胞内的ROS水平，具有作为治疗胆管癌的新临床治疗方案的可能。

综上所述，本研究发现胆管癌具有高表达NRF2的特点并且NRF2的高表达是胆管癌强增殖能力的重要原因。鸦胆子苦醇能够通过抑制胆管癌细胞内NRF2的表达从而发挥抑制胆管癌增殖的作用，具有应用于临床治疗的潜在可能。