TRIM59激活β-catenin/TCF4信号通路促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移

祝开忠，陈涛，陈焕雄，王挺锐，钟贞浩

骨肉瘤是临床上常见的恶性骨肿瘤之一，也是儿童肿瘤的主要类型之一，约占儿童所有恶性肿瘤的2.4%，约占所有原发性骨肿瘤的20%[1-3]。骨肉瘤是一种发生在骨骼中的疾病，其特征为异常生长和转移，主要表现为关节疼痛和疲劳等特征性症状。当前治疗这种恶性肿瘤的一个困难是骨肉瘤对传统化疗的耐药性[4-6]。尽管非转移性骨肉瘤的诊断和治疗有所改善，但转移患者的预后较差，5 年患者生存率低于20%[7]。因此，阐明骨肉瘤转移的机制尤为重要，以确定新的有效的靶向治疗，可能对提高骨肉瘤患者的总生存率具有重要作用。

三结构域（tripartite motif，TRIM）家族有超过70 多个成员，其中大部分蛋白属于E3 泛素连接酶，其共同特征是具有锌指结构域（RING）。这些蛋白参与了多种复杂的生物学过程，主要包括基因转录调控、细胞膜修复、细胞骨架重塑和肿瘤的生长及转移等[8]。TRIM 家族成员中包括TRIM13、TRIM19 和TRIM25 等，已被证明在白血病、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤发生过程中，通过转录因子的调节而发挥生物学活性[9-10]。TRIM59 作为一种表面分子，研究已经证明其与较多肿瘤的进展相关，其致癌特征于2011 年首次被研究者发现并报道[11]。此外，TRIM59 也已被确定为人类肿瘤发生过程中的生物标志物之一，主要包括乳腺癌[12]、肺癌[13]和膀胱癌[14]等。研究表明，TRIM59 的生物学活性与p53 的调控密切相关，TRIM59 与p53 作用使其发生泛素化降解从而促进肿瘤的生长和迁移[15]。此外，在转基因的前列腺癌小鼠模型中，观察到TRIM59 通过与Ras信号通路的相互作用而发挥其原癌基因功能[16]。然而，TRIM59 在人类骨肉瘤中的确切作用仍有待进一步予以阐明。β-catenin 信号通路在肿瘤的发生过程中起着关键性的作用，研究也证明了骨肉瘤中异常激活的β-catenin 信号通路与骨肉瘤的转移密切相关[17]，然而其异常激活机制尚有待进一步予以研究阐释。

本研究首先证实了TRIM59 在骨肉瘤组织及细胞中高表达，下调骨肉瘤细胞中TRIM59 的表达后，其侵袭及迁移能力明显减弱；在机制方面，本研究证实了TRIM59 通过激活β-连环蛋白（β-catenin）/转录因子4（transcription factor 4，TCF4）信号通路，进而影响骨肉瘤的侵袭及迁移。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集2015 年1 月—2019 年12 月由海南医学院第一附属医院收治的53 例骨肉瘤患者的肿瘤组织及其相应的非肿瘤组织（所有非肿瘤组织距离肿瘤边缘＞3 cm）标本。所有标本都经过病理医生诊断，且所有患者术前均未接受化疗，切除的新鲜组织立即放置于液氮中储存。本研究经过海南医学院第一附属医院医学伦理委员会审批同意，所有患者均已签署知情同意书。

1.2 细胞、试剂和仪器

骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、143B 及正常成骨细胞hFOB1.19 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；所有的细胞均培养于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM 培养液中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中进行。所有细胞实验均培养6 代以后使用。

FBS 及DMEM 培养液购自美国BI 公司。兔抗人TRIM59、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-catenin 和重组人TCF4 单克隆抗体，鼠抗人GAPDH（内参照）单克隆抗体，以及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgG 均购自英国Abcam公司。TRIM59-shRNA（shTRIM59）重组质粒及其阴性对照（negative control，NC）-shRNA（shNC）重组质粒均购自上海吉玛制药技术有限公司；shTRIM59 序列为5’-ACATTACAGGCAACCATTAAA-3’，shNC 序列为5’-AACAGTCGCGTTTGCGA CTGC-3’。转染试剂LipofectAMINE 3000 购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，反转录试剂 盒（PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser）和实时荧光定量PCR 试剂盒（TB Green Premix Ex Taq）均购自日本TaKaRa 公司。TRIM59 及GAPDH基因引物由广州锐博生物科技有限公司合成；TRIM59基因上游引物序列为5’-GGCTCTCTGTGATGTTGGVA-3’，下游引物序列为5’-TTCAAGCTGCTCTCGTA-3’；GAPDH基因上游引物序列为5’-CCTGCCG GTGACTAACCCTG-3’，下游引物序列为5’-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTG-3’。

实时荧光定量PCR 扩增仪为美国Bio-Rad公司产品，光学显微镜为美国Thermo Scientific公司产品。

1.3 实验动物

裸鼠（ALB/c-nu/nu、雄性、5 周龄、体质量为15～20 g）购自湖南斯莱克斯景达实验动物有限公司[SCXK（湘）：2019-0004]。均饲养于无特定病原体（specific pathogen-free，SPF）级实验室。

1.4 蛋白质印迹法检测

收集骨肉瘤细胞和手术获得的骨肉瘤组织标本30 例，加入RIPA 裂解液裂解细胞，组织则先行匀浆处理，再加入RIPA 裂解液裂解组织细胞；加 入PMSF 处理后，12 000×g离心10 min 收集上清液，采用BCA 法对蛋白进行定量。每组样品取40 μg 蛋白加入蛋白质缓冲液沸水浴处理10 min 使其变性后上样，行10% SDS-PAGE 分离蛋白；将分离后的蛋白转移至PVDF 膜上，用含5% 脱脂牛奶的封闭液封闭处理1 h 后，加入一抗[兔抗人TRIM59 单克隆抗体和鼠抗人GAPDH（内参照）单克隆抗体（体积稀释比例均为1 ∶1 000）] 4 ℃孵育过夜，经TBST 洗膜3 次后加入HRP 标记的山羊抗鼠IgG 或山羊抗兔IgG 室温孵育1 h，滴加电化学发光试剂，待显影后拍照保存并分析检测结果。

1.5 实时荧光定量PCR 法检测

收集骨肉瘤细胞和手术获得的骨肉瘤组织标本30 例。用TRIzol 试剂裂解细胞和均浆处理后的组织，提取细胞和组织中的总RNA。采用反转录试剂盒（PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser）将RNA 反转录为cDNA 后，并进一步用实时荧光定量PCR 试剂盒（TB Green Premix Ex Taq）进行下一步PCR 扩增。PCR 反应条件为预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 个循环；引物序列见1.2 节。以2-ΔΔCt值表示各目的基因的相对表达水平。

1.6 免疫组织化学检测

新鲜的骨肉瘤及其相应的非癌组织30 对经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后进行切片厚度为4 μm，将切片置于65 ℃的烤箱中烘烤3 h；进行脱蜡和水化后，滴加含5%牛血清白蛋白的封闭液室温封闭30 min；加入适量的一抗[兔抗人TRIM59 单克隆抗体（体积稀释比例为1 ∶150）]4 ℃反应过夜。滴加相应的生物素标记的二抗（工作液体积稀释比例为1 ∶2 000）室温孵育1 h，最后滴加HRP 标记的链亲和素，经DAB 显色后在光学显微镜下观察染色情况（放大倍数为200倍）。TRIM59 主要表达于细胞质中；根据染色强度和阳性细胞在总细胞中所占的百分比判定阳性强度，弱阳性（＋）为3 分，中阳性（＋＋）为6 分，强阳性（＋＋＋）为9 分。

1.7 构建TRIM59 基因沉默表达的骨肉瘤细胞

采用病毒感染的方法将携带有特异性针对TRIM59 基因的shRNA（shTRIM59）或阴性对照shRNA（shNC）的重组质粒转入骨肉瘤U2-OS 细胞；并进一步采用实时荧光定量PCR法（检测流程同1.5 节）和蛋白质印迹法（检测流程同1.4 节）检测感染效率。

1.8 Transwell 小室实验

采用基质胶包被（每孔约50 μL，静置30 min）Transwell 小室。将TRIM59 基因沉默表达的U2-OS 细胞以及对照组细胞接种于培养板中，于细胞培养箱中培养24～36 h 后，采用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，收集细胞经清洗后重悬细胞。计数后按2×104个/孔的密度接种于小室的上室中（每组设置3 个复孔）；继续培养48 h，取出小室并小心将未穿过小室膜的细胞拭去，用PBS 清洗后加入甲醇溶液固定细胞20 min，待细胞固定后加入0.1%结晶紫进行染色，于光学显微镜下（放大倍数为100 倍）观察细胞染色情况及形态（每组细胞观察4 个视野）并计数。

1.9 划痕愈合实验

将TRIM59 基因沉默表达的U2-OS 细胞以及对照组细胞接种于培养皿中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养至细胞铺满培养皿底部约80%～90%时，采用相同大小的枪头（如200 μL）进行划痕处理（务必保证每孔划痕粗细均匀）；用PBS 清洗脱落下来的细胞，并加入不含血清的培养液于培养箱中继续培养24 h 后，在倒置光学显微镜下（放大倍数为100 倍）观察划痕愈合情况，并拍照记录和分析愈合率。

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1.10 蛋白质印迹法检测沉默TRIM59 基因表达对骨肉瘤细胞中上皮-间质转化相关蛋白表达的影响

收集TRIM59 基因沉默表达的U2-OS 细胞以及对照组细胞，采用蛋白质印迹法检测U2-OS细胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 蛋白的表达水平，检测流程同1.4 节。一抗分别为兔抗人E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 单克隆抗体，以GAPDH 为内参照。

1.11 沉默TRIM59 基因表达对骨肉瘤细胞在小鼠肺转移中的影响

收集TRIM59 基因沉默表达的U2-OS 细胞以及对照组U2-OS 细胞，经胰蛋白酶消化计数后将细胞密度调整为1×107个/mL。每组6 只小鼠，每只裸鼠通过尾静脉注射100 μL 骨肉瘤细胞悬液；于SPF 级别的环境下进行饲养，4 周后将各组裸鼠通过安乐死的方法处死，取出裸鼠肺脏，石蜡包埋后行HE 染色检测双肺是否存在转移肿瘤。

1.12 TRIM59 对骨肉瘤细胞中β-catenin/TCF4信号通路活性的影响

首先采用蛋白质印迹法检测TRIM59 基因沉默表达的U2-OS 细胞以及对照组U2-OS 细胞中β-catenin/TCF4 信号通路相关蛋白β-catenin 和TCF4 的表达水平，检测流程同1.4 节。一抗分别为兔抗人β-catenin 和重组人TCF4 单克隆抗体，以GAPDH 为内参照。

随后，收集骨肉瘤143B 细胞，采用病毒感染的方法将TRIM59 过表达（overexpression，OE）重组质粒及对照空载体（Vector）转入细胞，然后采用β-catenin 信号通路抑制剂XAV939（10 μmol/L）处理TRIM59 过表达的143B 细胞24 h。采用蛋白质印迹法检测3 组细胞中β-catenin和TCF4 蛋白的表达水平。

最后，使用Transwell 小室及划痕愈合实验检测TRIM59 过表达和XAV939 抑制β-catenin/TCF4 信号通路活性后，143B 细胞侵袭（检测流程同1.8 节）及迁移（检测流程同1.9 节）能力的变化情况。

1.13 统计学方法

采用SPSS 26.0 及Prism 7 统计软件对所有的研究数据进行统计分析。癌及癌旁组织比较采用配对样本t检验；所有的实验均独立重复3 次，数据用表示，多组均数之间的比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织及细胞中TRIM59 的表达升高

为阐明TRIM59 在骨肉瘤中的表达水平及作用，本研究首先检测30 例人骨肉瘤组织及其癌旁正常组织中TRIM59 蛋白的表达水平。蛋白质印迹法检测结果（图1A）显示，30 例骨肉瘤组织中23 例TRIM59 蛋白的表达水平明显高于相应的癌旁组织（P＜0.01），7 例癌组织中TRIM59蛋白的表达水平与癌旁组织无明显差异。图1A展示了6 例具有代表性的TRIM59 蛋白表达水平较高的病例。

进一步采用免疫组织化学法检测了30 例骨肉瘤组织中TRIM59 蛋白的表达水平。结果（图1C）同样表明也证实了TRIM59 的表达明显高于相应的癌旁组织，其中肿瘤组织中TRIM59 的阳性率为76.67%（23/30），而癌旁组织中阳性率仅为16.67%（5/30）。

进一步通过实时荧光定量PCR 法（图1D）及蛋白质印迹法（图1E）证实了，骨肉瘤U2-OS、MG-63 及143B 细胞中TRIM59 mRNA（P＜0.05）及蛋白的表达水平均明显高于正常成骨细胞hFOB1.19。上述结果表明，TRIM59 在骨肉瘤细胞及组织中表达升高。

Fig.1 The expression level of tripartite motif family protein 59 (TRIM59) in osteosarcoma tissues and cells were up-regulated.A: Western blotting was used to detect the expression level of TRIM59 protein in tumor tissues (T) and adjacent-carcinoma tissues (N) (The TRIM59 protein expression level in six typical osteosarcoma tissues and adjacent-cancerous tissues was displayed) (**P＜0.01).B: The expression level of TRIM59 mRNA in osteosarcoma tissues was significantly higher than that in para-carcinoma tissues(**P＜0.01).C: The expression level of TRIM59 protein was detected by immunohistochemistry (IHC) (DAB staining,×100) (**P＜0.01).D and E: Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect TRIM59 mRNA and protein expression levels in osteosarcoma U2-OS,MG-63,143B cells and normal osteoblast hFOB1.19 cells (as the control) [△P＜0.05,△△P＜0.05,the control group (n=3)].图1 分别采用蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR 法及免疫组织化学法检测30 例骨肉瘤组织及其癌旁组织（A～C）以及骨肉瘤细胞中TRIM59 mRNA 和蛋白的表达水平（D～E）

2.2 下调骨肉瘤细胞中TRIM59 的表达水平后能抑制骨肉瘤细胞的侵袭及迁移能力

骨肉瘤的一个重要特征是其具有较高的转移性，最近研究也证实了肺癌及胃癌中TRIM59 的表达与肿瘤的转移密切相关。为了检测TRIM59是否同样影响骨肉瘤的转移，本研究中采用病毒感染的方法将携带有shTRIM59 的重组质粒转入骨肉瘤U2-OS 细胞，并采用实时荧光定量PCR 及蛋白质印迹法验证其转染效率，结果提示TRIM59 mRNA（图2A）及蛋白（图2B）的表达水平均较对照组明显下调（P均＜0.01）。

随后采用Transwell 小室实验和划痕愈合实验检测了沉默TRIM59 表达对骨肉瘤细胞侵袭及迁移能力的影响。结果显示，TRIM59 表达下调后U2-OS 细胞的侵袭（图2C）和迁移（图2D）能力均明显降低（P均＜0.01）。

进一步采用蛋白质印迹法检测了沉默TRIM59 表达对骨肉瘤U2-OS 细胞中上皮-间质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 表达水平的影响，结果（图2E）显示，TRIM59 表达下调后U2-OS 细胞中N-cadherin和Vimentin 蛋白的表达水平明显下调（P均＜0.05），而E-cadherin 蛋白的表达水平明显上调（P＜0.05）。

对小鼠肺组织的HE 染色结果（图2F）显示，尾静脉注射骨肉瘤U2-OS/shNC 和U2-OS/shTRIM59 细胞后，对照组6 只小鼠中5 只发生肺转移，shTRIM59 组6 只小鼠中仅有1 只发生肺转移。以上结果表明，下调骨肉瘤细胞中TRIM59的表达水平后其体内外转移的能力明显减弱。

Fig.2 Effect of down-regulation of tripartite motif family protein 59 (TRIM59) expression level on invasion and migration abilities of osteosarcoma U2-OS cells and its possible mechanism.A-B: Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to verify the expression levels of TRIM59 protein and mRNA in U2-OS cells transfected with shTRIM59.C-D: After down-regulated the expression level of TRIM59 in osteosarcoma U2-OS cells,Transwell assay and Wound healing experiment were used to detect its invasion and migration abilities.E: Western blottign was used to detect the expression level of epithelialmesenchymal transition (EMT)-related proteins (N-cadherin,E-cadherin and Vimentin).F: HE staining result of lung tissues in six mice (tail vein injection of shNC/U2-OS or shTRIM59/U2-OS cells).U2-OS cells were transfected with shNC.*P＜0.05,**P＜0.01,vs shNC group (n=3).图2 下调TRIM59 表达水平对骨肉瘤U2-OS 细胞侵袭及迁移能力的影响及可能的作用机制

2.3 TRIM59 通过激活β-catenin 信号通路影响骨肉瘤细胞的侵袭及迁移

有研究报道，Wnt/β-catenin 信号通路活化是一个重要的致癌过程，在肿瘤的发生及发展中起着关键性作用[18]。蛋白质印迹法检测结果（图3A）显示，下调骨肉瘤U2-OS 细胞中TRIM59 蛋白的表达水平后，β-catenin 和TCF4 蛋白的表达水平均明显下调（P均＜0.05）；这一结果提示下调TRIM59 表达后β-catenin/TCF4 信号通路明显被抑制。

本研究中进一步将携带有TRIM59 基因的重组过表达载体转入骨肉瘤143B 细胞中，然后采用β-catenin 信号通路抑制剂XAV939（10 μmol/L）处理24 h。蛋白质印迹法检测结果（图3B）表明，上调TRIM59 表达后，β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin 和TCF4 的表达水平均明显上调（P均＜0.05），但在加入XAV939 抑制剂后，激活的β-catenin 信号通路相关蛋白均恢复表达水平，即表达水平下调（P均＜0.05）。最后通过Transwell 小室（图3C）及划痕愈合实验（图3D）表明，上调TRIM59 表达后骨肉瘤细胞的侵袭及迁移能力明显增强（P均＜0.05），而加入XAV939 抑制剂后，其侵袭及迁移能力恢复（P均＜0.05）。上述结果表明，TRIM59 可能通过激活β-catenin/TCF 信号通路进而影响骨肉瘤的侵袭及迁移。

Fig.3 Tripartite motif family protein 59 (TRIM59) affects the invasion and migration of osteosarcoma by activating β-catenin signaling pathway.A: The expression levels of TRIM59,β-catenin and transcription factor 4 (TCF4) proteins in osteosarcoma U2-OS cells transfected with shTRIM59 were detected by Western blotting.U2-OS cells were transfected with shNC as the control.B: The expression levels of TRIM59,β-catenin and TCF4 proteins in osteosarcoma 143B cells treated with TRIM59 overexpression(OE) recombinant plasmid (OE-TRIM59) or OE-TRIM59 combined with inhibitor XAV939 (10 μmol/L)were detected by Western blotting.C-D: Transwell assay and Wound healing experiment were used to detect invasion and migration abilities of 143B cells treated with OE-TRIM59 or OE-TRIM59 combined with inhibitor XAV939.143B cells were treated with empty vector as the control.*P＜0.05,**P＜0.01 (n=3).图3 TRIM59 通过激活β-catenin 信号通路促进骨肉瘤细胞的侵袭及迁移

3 讨论

骨肉瘤是青少年最常见的恶性肿瘤之一，据报道，美国每年有接近三分之一的骨肉瘤患者死亡，其中大多数是青少年，其主要原因是其恶性程度高，发现早期易发生肺部转移等[19-20]。因此，亟需进一步的研究来帮助发现新的诊断和预后生物标志物，以及更好地理解和掌握骨肉瘤发展的机制。

近年来，越来越多的修剪蛋白被研究者密切关注，据报道其对人类癌症的进展至关重要。例如，TRIM44和TRIM26的表达被研究者发现与肝癌患者的生存期密切相关[21-22]；TRIM29在膀胱癌中高表达且与预后密切相关，细胞中下调膀胱癌细胞中TRIM29的表达后期侵袭及迁移能力明显减弱[23]。研究还表明在乳腺癌细胞中，TRIM37[24]和TRIM46[25]可以抑制癌细胞的增殖和肿瘤的生长。TRIM59已被报道为多种人类癌症的肿瘤启动子，包括肺癌、胃癌和宫颈癌等。ZHAN等[26]发现，TRIM59通过调控细胞周期蛋白B1（cyclin B1）/细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cycle 25 homolog C，CDC25C）/周 期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）蛋白进而促进非小细胞肺癌的转移和增殖。此外，有报道称TRIM59与p53相互作用，促进其在胃肿瘤中的泛素化和降解[15]。LI等[27]研究也证实，TRIM59在胰腺癌中高表达，其通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号轴调控胰腺癌的进展。同样，研究也证实β-catenin/TCF4信号通路异常激活与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关，抑制β-catenin/TCF4信号通路的激活对肿瘤的治疗具有重要意义，针对该信号通路的靶向抑制剂研究更是肿瘤领域研究的热点。

本研究中发现，TRIM59在骨肉瘤组织中mRNA和蛋白的表达水平均明显上调。利用siRNA干扰技术沉默TRIM59表达后可抑制骨肉瘤U2-OS细胞的侵袭及迁移能力，而过表达TRIM59则可促进U2-OS细胞的侵袭及迁移能力；随后通过小鼠体内实验也证实了TRIM59下调能够抑制U2-OS细胞的转移能力。最后本研究在机制上证实了，TRIM59通过激活β-catenin信号通路进而影响骨肉瘤的侵袭及迁移。综上所述，本研究结果可能为骨肉瘤的靶向治疗提供更多的初步理论依据。