单细胞分析微环境与髓母细胞瘤预后的关系

罗文钦，杨茹

髓母细胞瘤是儿童中最常见的脑肿瘤之一，是一种发生在小脑蚓部小细胞分化不良的恶性肿瘤[1-2]，其生物学机制尚未完全阐明。在髓母细胞瘤中，微环境的细胞分群与髓母细胞瘤预后关系的研究更是鲜有报道。本课题组前期已采用转基因小鼠Patched＋/-髓母细胞瘤模型，研究了髓母细胞瘤发生早期Sonic hedgehog（SHH）信号通路对小脑颗粒神经元前体细胞（granule neuron progenitor，GNP）分裂模式的调控作用[3]，并发现对称不对称分裂关键调控因子和抑癌基因Trim32通过结合并降解SHH信号通路中的关键因子Gli1[4]，从而抑制髓母细胞瘤的进展。随着单细胞测序技术的迅速发展，为研究肿瘤微环境的细胞分群与髓母细胞瘤的关系提供了技术支撑。

世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将髓母细胞瘤归类为Ⅳ级肿瘤。随着分子生物学的发展，基于高通量的基因测序、基因表达谱及基因拷贝数异常的分析，WHO（2016年）中枢神经系统肿瘤分类将髓母细胞瘤分为4 种不同的亚型：SHH型、WNT型、3型（Group3）和4型（Group4）[5]。其中，SHH型髓母细胞瘤是目前研究最广泛的一种分型，其根据SHH信号转导通路命名[6]。有研究采用谱系追踪技术证实，SHH型髓母细胞瘤是由特异性表达Math1基因的GNP恶性转化而来[7-8]。GNP的增殖受SHH信号通路的调控，在小脑发育早期，浦肯野纤维细胞分泌SHH糖蛋白，与GNP表面的Patched受体结合，解除其对下游信号接收器Smoothened（SMO）蛋白的抑制作用，激活Gli家族的转录因子（Gli1等），促进下游与增殖相关基因的转录表达，从而诱导GNP大量增殖[9]。当编码Patched受体和SMO蛋白的基因发生突变，SHH信号通路被异常激活，可导致GNP恶性转化形成髓母细胞瘤。其中，Patched基因纯合突变小鼠，因神经系统、心脏和其他器官缺陷，在胚胎发育期即死亡，而Patched基因杂合突变小鼠（Patched＋/-）在出生3～6个月后，14%～20%的小鼠可产生髓母细胞瘤，是研究髓母细胞瘤的一个重要模型。Math1基因启动子驱动的Cre重组酶转基因小鼠（Math1-Cre/SmoM2，M-Smo）可使SMO基因的突变特异地发生在GNP，小鼠在出生12 d（P12）后100%会发生髓母细胞瘤[10]，也是研究髓母细胞瘤的一个重要模型。

近年来，随着单细胞RNA测序技术（singlecell RNA sequencing，scRNA-seq）的蓬勃发展，通过该技术可以从单细胞水平获得基因表达谱，了解细胞的异质性，发现新的细胞类型、相关细胞的标志基因及新细胞类型的潜在功能[11-14]。有研究利用scRNA-seq技术，探索小鼠出生前后小脑细胞的差异，通过与髓母细胞瘤患者RNA表达数据的比对分析，证实肿瘤细胞在基因表达谱上更类似于小鼠出生后早期的GNP，为临床诊断和治疗提供了新的角度[15-16]。另有研究表明，M-SMO转基因小鼠形成的髓母细胞瘤在采用SMO蛋白抑制剂维莫德吉（vismodegib）治疗后，增殖活跃的颗粒神经元前体细胞样（GNPlike）肿瘤细胞所占的比例明显降低，通过比较治疗组和对照组的肿瘤细胞的基因表达差异，即可找出治疗肿瘤干细胞的靶基因[10]。然而，这些髓母细胞瘤的scRNA-seq研究仍旨在探索肿瘤细胞本身，而忽视对肿瘤微环境细胞的探索。

肿瘤微环境在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用，与肿瘤生长、转移和耐药等行为密切相关[17-18]。有研究表明，肿瘤浸润性免疫细胞如淋巴细胞能够影响患者的预后，并且可以预测患者对化疗的敏感性[19]。在髓母细胞瘤中，有研究指出SHH型肿瘤微环境较其他3种类型的肿瘤微环境可富集更多的肿瘤相关性巨噬细胞，提示这类细胞是靶向治疗的关键对象[20]；此外，星形胶质细胞的存在可促进髓母细胞瘤的发生和发展[21]，上述研究皆提示，靶向干预肿瘤微环境是治疗髓母细胞瘤的热点。然而，当前在髓母细胞瘤中却依然缺乏靶向干预肿瘤微环境的有效手段，可能是因为缺乏对髓母细胞瘤微环境的全面认识。因此，认识髓母细胞瘤微环境的细胞分群，有助于探讨不同微环境细胞与髓母细胞瘤患者预后的关系，推测其对肿瘤发生和发展的影响，并揭示其作为靶向治疗目标的潜能。

本研究旨在整合正常小鼠和髓母细胞瘤小鼠模型，包括使用vismodegib治疗肿瘤小鼠的scRNA-seq数据[10]，探讨不同状态下微环境细胞比例的变化情况。结合患者的RNA表达数据[22]进行分析，揭示不同微环境细胞群与患者预后及临床特征之间的关系，推测不同微环境细胞群对肿瘤发生和发展的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

用于单细胞测序的5只C57BL/6J小鼠分别为3只Patched＋/-转基因小鼠和2只野生型（wild-type，WT）小鼠。Patched＋/-转基因小鼠购自美国Jackson实验室（货号：003081），WT小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0004]。髓母细胞瘤样本取自Patched＋/-转基因小鼠培育50周后形成的肿瘤，WT小鼠的小脑组织取自出生后第7天（P7）以及第11天（P11）的小鼠。本研究中使用的小鼠均饲养在上海交通大学医学院附属仁济医院无特定病原体（specific pathogenfree，SPF）级动物中心[动物饲养许可证号：SYXK（沪）2016-0012]。饲养温度和湿度统一控制，所有动物实验方案都通过仁济医院动物研究伦理委员会的批准。

1.2 试剂及仪器

DMEM培养液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公 司，2×Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。EDTA溶液、TAE缓冲液和Tris-HCl（pH值＝5.5）缓冲液购自生工生物工程（上海）股份有限公司。胰蛋白酶、胶原酶、DNA酶和淋巴细胞分离液购自中国碧云天生物技术公司。

PCR仪（型号：T100TMThermal Cycler）为美国Bio-Rad公司产品，CO2培养箱（型号：Thermo3111）为美国Thermo Fish公司产品，冷冻离心机（型号：Centrifuge 5424R）为购自德国Eppendof公司产品。

10×Genomics是一个美国基因测序技术服务平台，主要为用户提供Chromium系统，以单个细胞分辨率复制数字分析，适用于基因表达谱分析、单细胞免疫分析、外显子组测序和基因组测序等领域。本研究采用的10×Genomics平台服务由晶能生物技术（上海）有限公司提供，使用的RNA测序仪是美国Illumina公司的NovaSeq 6000测序仪。

1.3 单细胞RNA测序流程

本研究中的单细胞RNA测序流程包括单细胞悬液制备、建库以及上机测序，详细流程参见10×Genomics官 网https://www.10×genomics.com。流程如下：（1）制备单细胞悬液，将小脑组织转移至装有1 mL DMEM培养液的1.5 mL离心管中，先加入100×胶原酶和100×DNA酶15 μL，随后加入470 μL DMEM培养液补齐至1.5 mL并盖紧离心管，置于37 ℃培养箱中，期间每隔10 min上下颠倒摇晃1 min；1 h后从培养箱内拿出，用200 μL枪头轻柔吹打2～3 min，350×g离心5 min，除去上清液。随后加入含EDTA的1 mL胰蛋白酶重悬沉淀，采用200 μL枪头轻柔吹打使细胞散开，继续置于37 ℃培养箱中消化10 min；之后350×g离心5 min，除去上清液。用600 μL含10% FBS的DMEM培养液重悬沉淀，并将枪头插入管底，缓慢加入300 μL淋巴细胞分离液，此时离心管内样本分为2层，上层为细胞悬液，下层为淋巴细胞分离液，注意不要晃荡离心管，保持液面分层。之后800×g离心20 min，注意此时需使用水平转子，并设置离心机加速度和减速度均为2，防止上下层溶液相混。离心结束后可发现离心管中样本分为3层，最下层为红细胞和死细胞碎片，中间层是淋巴细胞分离液和少量的活细胞，最上层主要为活细胞悬液，即为实验需要的单细胞悬液。（2）建库，本研究采用基于10×Genomics的ChromiumTMSingle Cell 3’ Solution进行建库，该方法能够一次性分离、标记500～10 000个单细胞，并进行无偏的3’端基因表达信息的建库，具有操作简捷，分辨率高，能够比较单个细胞间的转录组差异等优点。（3）上机测序，构建好的文库通过NovaSeq 6000（Illumina）测序仪进行测序，测序数据量为每个样品约400 M reads。

本研究的单细胞RNA数据已上传至基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO），具体网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/ac-c.cgi?acc＝GSE156633。

1.4 M-SMO转基因小鼠和髓母细胞瘤临床标本

M-SMO转基因小鼠的单细胞RNA数据从GEO数据库（GSE129730）中下载，共包括10只M-SMO转基因小鼠形成的髓母细胞瘤样本。10只小鼠被随机分为2组：一组使用SMO抑制剂维莫德吉（vismodegib）进行治疗，一组使用空载体（vector）进行对照研究。该数据库对应的研究已证实，与对照组相比，vismodegib治疗组小鼠髓母细胞瘤中GNP-like肿瘤细胞所占百分比明显降低，表明药物治疗对肿瘤细胞有效。

髓母细胞瘤患者的RNA表达数据从GEO数据库（GSE124814）中下载，该数据共整合了23个数据集中SHH型的髓母细胞瘤患者的RNA表达数据，包括405例患者，临床信息详见表1。

表1 GEO数据库（GSE124814）获得的405例SHH型髓母细胞瘤患者的临床特征Table 1 The characteristics of 405 patients with SHH medulloblastoma from Gene Expression Omnibus (GEO)dataset (GSE124814)(N＝405)

1.5 单细胞RNA数据降维分析

本研究采用R语言软件Seurat程序包的单细胞分析流程对scRNA-seq数据矩阵进行分析。（1）创建Seurat对象：采用Seurat程序包中Read10×函数读取scRNA-seq数据矩阵，创建Seurat对 象；（2）数据质控（quality check，QC）：采用细胞特异性表达的基因去除红细胞等不在研究范围内的细胞，设置所有基因在每个细胞中总表达量的最低阈值，进一步过滤低质量细胞；（3）对数据进行标准化（Normalize Data）：采用Seurat程序包的Normalize Data函数，对每个样本数据进行全局缩放归一化（globalscaling normalization），即用总表达量对每个单元格的基因表达量进行归一化，然后将其乘以缩放因子（默认为10 000），对结果进行对数转换；（4）可视化细胞分群：采用无监督方法对数据进行降维分析，基于数据中2 000个高可变基因（highly variable genes，HVG）进行主成分分 析（principal component analysis，PCA），设置参数“维度（dims）”为30，进行细胞聚类分群，最后采用t分布随机邻域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）或统一流形逼近与投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）算法体现可视化细胞分群结果。t-SNE和UMAP算法都是将细胞分群以二维平面的形式呈现，分别以t-SNE_1或UMAP_1作为横坐标以及t-SNE_2或UMAP_2作为纵坐标。

1.6 细胞类型识别

参阅参考文献中相应细胞的标志基因[23]，对细胞分群进行命名：Cd3d和Cd3e是T细胞（T cells）的标志基因，Col1a1是成纤维细胞（fibroblasts）的标志基因，Aqp4和aldh1l1是星形胶质细胞（astrocytes）的标志基因，Olig1和Olig2是少突胶质细胞（oligodendrocytes）的标志基因；Aif1和Cd68是小胶质细胞（microglia）的标志基因；Cdh5和Cldn5是内皮细胞（endothelial cells）的标志基因。采用Seurat程序包中的FeaturePlot功能展示标志基因在单细胞聚类图中的表达情况。

1.7 微环境细胞整合分析

取生长至第7天和第11天的2只WT小鼠的小脑组织，以及3只Patch＋/-转基因小鼠形成的髓母细胞瘤样本，进行scRNA-seq，并提取微环境细胞进行降维分析。从GEO数据库（GSE129730）下载采用vismodegib治疗组以及空载体（vector）处理的对照组M-SMO转基因小鼠肿瘤的scRNA-seq数据矩阵，并对微环境细胞进行降维分析。对2组数据中微环境细胞的scRNA-seq数据矩阵进行整合分析（integration analysis），用于综合分析比较肿瘤与正常小脑组织中微环境细胞数量的差异，并且比较vismodegib治疗组与对照组之间微环境细胞数量的差异。

1.8 基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA）

采用Seurat程序包对不同细胞群进行差异表达基因分析（differential gene expression analysis，DEG），选取差异表达P＜0.05且差异倍数（fold change，FC）即|log2FC|＞0.25的基因，作为每种细胞类型的特异性表达基因集（gene set），分别定义为T细胞相关基因（T cell-related gene）、小胶质细胞相关基因（microglia-related gene）、成纤维细胞相关基因（fibroblast-related gene）、星形胶质细胞相关基因（astrocyte-related gene）、少突胶质细胞相关基因（oligodendrocyterelated gene）和内皮细胞相关基因（endothelial cell-related gene）；采用GSVA程序包对髓母细胞瘤患者的RNA表达数据分别计算上述基因集的基因得分，微环境细胞相关基因的GSVA得分即表示微环境相关基因的表达水平，同时也可用于表示微环境细胞的富集程度。

1.9 生存分析

采用GSVA程序包对髓母细胞瘤患者的RNA表达数据计算T细胞相关基因、小胶质细胞相关基因、成纤维细胞相关基因、星形胶质细胞相关基因、少突胶质细胞相关基因和内皮细胞相关基因的得分；使用survminer程序包的surv_cutpoint函数寻找GSVA得分的分组阈值，并根据这个阈值把GSVA得分分为得分高（high）和得分低（low）2组，最后采用Kaplan-Meier法分析2组患者的总生存（overall survival，OS）时间。

1.10 细胞比例分析

计算不同微环境细胞群中肿瘤和正常样本的构成比，采用χ2检验比较2者之间的差异，随后计算不同微环境细胞群中vismodegib治疗组和对照组样本的构成比，并进行χ2检验；在SHH型髓母细胞瘤患者RNA数据中对所有微环境细胞相关基因得分进行聚类分析，将405例患者分为A组和B组，以每一例患者RNA数据中所有微环境细胞相关基因得分的最大值对应的微环境细胞类型作为该患者的主要微环境细胞成分，计算2组患者中主要微环境细胞类型所占的比例，使用circlize程序包制作弦状图展示2组患者的微环境细胞比例，并采用χ2检验比较2组的细胞比例差异。

1.11 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.00统计学软件对数据进行统计学分析。采用χ2检验比较不同分组之间的细胞比例差异；生存分析采用Kaplan-Meier法，进行log-rank检验；采用COX风险比例回归模型进行髓母细胞瘤患者预后的多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单细胞测序及单细胞分析流程

解剖获得Patched＋/-转基因小鼠培育50周后形成的髓母细胞瘤和正常小鼠的小脑（WT cerebellum）组织，进行单细胞RNA测序。对获得的所有微环境细胞进行降维分析，一共捕获2 077个微环境单细胞（图1A）。从GEO数据库（GSE129730）中下载对M-SMO转基因小鼠培育形成的髓母细胞瘤中的微环境细胞进行单细胞降维分析而获得的1 781个微环境单细胞（图1B）。随后对2个微环境单细胞RNA数据矩阵进行整合分析，共获得3 859个微环境单细胞（图1C）。由于采用的小鼠模型都是髓母细胞瘤的动物模型，因此获得的微环境单细胞可用于描述小鼠髓母细胞瘤微环境的细胞分群情况。

Fig.1 Workflow for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and analysis of microenvironment.A:Workflow for tissue collection,single-cell digestion,sequencing and analysis of microenvironment in two wild-type (WT) mice cerebellum and three Patched+/- medulloblastoma mouse models.B: Analysis of microenvironment in Math1-Cre/SMOM2 (M-SMO) medulloblastoma mouse models from GSE129730 dataset.C: Integration analysis of microenvironment from two scRNA-seq datasets.图1 小鼠髓母细胞瘤的单细胞测序流程以及微环境的单细胞分析

2.2 髓母细胞瘤小鼠模型和WT小鼠小脑组织微环境细胞图谱

对WT小鼠的小脑组织和SHH型髓母细胞瘤小鼠模型肿瘤组织的微环境细胞进行整合分析，共获得3 859个细胞，降维分析结果显示微环境细胞一共分为12个细胞群（图2A）。根据细胞标志基因的表达情况（图2B），将12个细胞群分别定义为T细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞。随后的单细胞基因表达图（Feature Plot）（图2C）显示，标志基因确实特异地表达在对应的微环境细胞类型中，Cd3d基因特异地表达在T细胞中，Col1a1基因特异地表达在成纤维细胞中，Aqp4基因特异地表达在星形胶质细胞中，Olig1基因特异地表达在少突胶质细胞中，Cd68基因特异地表达在小胶质细胞中，而Cldn5基因特异地表达在内皮细胞中，表明细胞类型定义准确。此外，分群结果中检测到T细胞这个分群，这在以往小鼠小脑的单细胞测序研究中并未出现[15-16,23]。

Fig.2 Single-cell transcriptome profiling of microenvironment in Sonic Hedgehog (SHH)medulloblastoma mouse models and wild-type (WT) cerebellum.A: Uniform manifold approximation and projection (UMAP) visualization of all 3 859 microenvironmental cells from two datasets with cells colored according to the corresponding cell types;x axis and y axis indicate two dimensions.B: Dot plot for expression of marker genes in microenvironmental cell types.The color represents average expression of marker genes in each cell type,and the size indicates the proportion of cells expressing marker genes.C:Feature Plot showing the signature gene expression of each microenvironmental cell type in the form of UMAP;x axis and y axis indicate two dimensions.图2 采用UMAP算法获得的髓母细胞瘤小鼠模型和WT小鼠小脑微环境细胞可视化分群图谱

2.3 比较不同类型样本中微环境细胞数量的差异

对样本来源和细胞构成比例进行分析。对肿瘤和正常样本的分析结果（图3A）显示，T细胞和内皮细胞只出现在肿瘤样本中。此外，肿瘤较正常样本具有更多的少突胶质细胞和小胶质细胞（P＜0.001），具有更少的星形胶质细胞（P＜0.001）。此外，对vismodegib治疗组和空载体（vector）对照组的分析结果（图3B）显示，与采用空载体（vector）处理的对照组相比，采用vismodegib治疗肿瘤后，T细胞群只富集在治疗组的样本中（P＜0.001），并且治疗组样本较对照组样本具有更多的成纤维细胞和小胶质细胞，及更少的内皮细胞和少突胶质细胞（P均＜0.001）。已知SHH型髓母细胞瘤小鼠模型在使用vismodegib治疗后，增殖活跃的肿瘤干细胞所占比例明显下调，表明治疗有效。本研究中vismodegib治疗后T细胞、成纤维细胞和小胶质细胞数量的增加可能发挥着抑制肿瘤发生和发展的功能，而内皮细胞和少突胶质细胞所占比例下调可能发挥促进肿瘤发生和发展的功能。

Fig.3 Comparison of the proportion of microenvironmental cell types in different types of samples.A:Uniform manifold approximation and projection (UMAP) visualization of microenvironmental cell types in different microenvironment sources (tumor vs normal);x axis and y axis indicate two dimensions.B: Bar plot showing the cell proportion of microenvironmental cell types in different microenvironment sources(tumor vs normal) [P＜0.000 1 (chi-square test)].C: UMAP visualization of microenvironmental cell types in different treatment strategies (vismodegib vs vector);x axis and y axis indicate two dimensions.D: Bar plot showing the cell proportion of microenvironmental cell types in different treatment strategies (vismodegib vs vector) [P＜0.001 (chi-square test)].图3 采用UMAP图展示不同来源样本[肿瘤和正常组织的构成比（A）以及vismodegib治疗组和对照组（B）]的微环境细胞分群情况以及微细胞群的构成比

2.4 肿瘤微环境细胞群对髓母细胞瘤患者预后的影响

为进一步探讨微环境细胞群对肿瘤发生和发展的影响，对405例SHH型髓母细胞瘤患者的RNA表达数据进行GSVA分析，获得微环境细胞群相关基因的GSVA得分，随后基于GSVA得分分析患者的OS期。结果显示，高表达小胶质细胞和成纤维细胞相关基因的患者OS期较长（图4A和4B，P均＜0.05），结合vismodegib治疗后肿瘤小鼠中小胶质细胞和成纤维细胞比例增加的结果，表明这2种细胞的存在可能抑制肿瘤的发生和发展。同样地，本研究中发现高表达少突胶质细胞相关基因患者OS期的较短（图4C，P＝0.002 8），结合vismodegib治疗后肿瘤小鼠中少突胶质细胞比例降低的结果，表明少突胶质细胞的存在可能促进肿瘤的发生和发展。本研究中还发现，高表达星形胶质细胞（图4D）、内皮细胞（图4E）和T细胞相关基因（图4F）患者的OS期并没有出现明显的差异，因此未来尚需通过进一步的研究，探讨这3个相关基因对肿瘤发生和发展的影响。

Fig.4 The correlation between microenvironmental cell type-related genes (microglia-related gene,fibroblasts-related gene,oligodendrocytes-related gene,astrocytes-related gene,endothelial cells-related gene and T cells-related gene) scores and overall survival (OS) of medulloblastoma patients was analyzed by Kaplan-Meier method.图4 Kaplan-Meier法分析微环境细胞相关基因得分和髓母细胞瘤患者OS期的相关性

2.5 肿瘤微环境细胞富集程度与患者临床特征之间的关系

为了探讨肿瘤微环境细胞富集程度与患者临床特征之间的关系，本研究中首先以微环境细胞相关基因的GSVA得分表示患者微环境细胞群的富集程度。通过对微环境细胞群富集程度的热图（图5A）聚类分析显示，405例患者被分为2组，A组有患者186例，B组有患者219例；A组患者主要有富集内皮细胞、成纤维细胞和小胶质细胞，B组患者主要有富集星形胶质细胞和少突胶质细胞。对2组患者的OS期进行分析，结果（图5B）显示，A组患者的预后较好，而B组患者的预后较差（P＝0.004），结合A组患者的微环境细胞富集特征（图5A），进一步证实成纤维细胞和小胶质细胞具有抑制肿瘤发生和发展的作用，而少突胶质细胞在髓母细胞瘤中则可能具有促进肿瘤发生和发展的作用。

随后对所有患者临床特征进行分析。结果（图5C）显示，B组中具有更多的未成年患者（＜18岁）（P＜0.001），并且组织病理学上更多地表现为大细胞和间变型（large cell and anaplastic，LCA）（P＜0.001）。根据以往报道[24-25]，青少年患者组织病理学常表现为LCA型，而LCA型患者的临床预后极差，这可能进一步佐证了为何B组患者预后更差的结论。

Fig.5 The correlation between enrichment level of microenvironmental cell types and the clinical characteristics of patients with medulloblastoma.A: Heatmap showing the gene set variation analysis (GSVA)scores indicating the enrichment level of microenvironmental cell types in human SHH medulloblastoma patients from Gene Expression Omnibus (GEO): GSE124814 with annotation of characteristics including age,histology,metastatic stage and gender.B: Survival curves of Group A and Group B were analyzed by Kaplan-Meier method (log-rank test).C: Bar plot showing the proportion of clinical characteristics in Group A and Group B (chi-square test).LCA: Large cell and anaplastic;MBEN: Medulloblastoma with extensive nodularity;NOS: No-molecular study;M1: Distant metastasis;M0: Without metastasis.图5 肿瘤微环境细胞富集程度与髓母细胞瘤患者临床特征之间的关系

2.6 肿瘤微环境细胞共同调控髓母细胞瘤的发生和发展

肿瘤微环境细胞通过相互作用共同调控肿瘤发生和发展的进程，为探讨微环境细胞群对髓母细胞瘤患者的共同调控机制，将每位患者GSVA得分的最大值对应的细胞类型定义为患者具有的主要微环境细胞成分，对A组和B组患者的主要微环境细胞成分进行组成分析（图6A），结果显示A组患者主要包含小胶质细胞、成纤维细胞和内皮细胞，相反B组患者主要包含少突胶质细胞和星形胶质细胞（P＜0.001），与图5A的结果一致。相关性分析结果（图6B）显示，小胶质细胞，成纤维细胞和内皮细胞的相关性更高（r均＞0.8），而少突胶质细胞和星形胶质细胞的相关性更高（r均＞0.4），提示不同细胞群之间是共同调控肿瘤发生和发展过程的。结合生存分析结果，小胶质细胞和成纤维细胞可能是通过相互作用共同抑制肿瘤的进展，因此A组患者的预后较好。尽管少突胶质细胞和星形胶质细胞相关性很高，但是当富集为星形胶质细胞时，患者OS期之间的差异无统计学意义；由此推测，可能是由于少突胶质细胞发挥了促进肿瘤进展的作用，从而揭示了B组患者预后较差的原因。

COX多因素风险回归模型分析结果（表2）显示，少突胶质细胞相关基因的GSVA得分是髓母细胞瘤患者生存期的独立危险因素，其得分越高，患者的OS期越短[风险比（hazard ratio，HR）＝1.601，95%可信区间（confidence interval，CI）为1.011～127.829，P＝0.049]；此外协变量中，发生转移也是患者OS期的危险因素。相反，成纤维细胞相关基因的GSVA得分越高（表3），患者的OS期越长（HR＝0.066，95%CI为0.013～0.331，P＜0.001）；协变量中，肿瘤不发生转移是患者OS期的保护因素。综上所述，提示当肿瘤微环境富集少突胶质细胞时，肿瘤更容易发生转移，反之当肿瘤微环境富集成纤维细胞时，肿瘤则不易发生转移。

表3 多因素COX风险模型分析成纤维细胞、小胶质细胞和内皮细胞相关基因得分与髓母细胞瘤患者OS期的相关性Table 3 Multivariate COX proportional-hazards model analysis of the relationship between fibroblast-,microglia-and endothelial cell-related gene scores and the overall survival (OS) of patients with medulloblastoma

Fig.6 The co-effects of microenvironmental cell types on the progression of medulloblastoma.A: The proportion of microenvironmental cell types in Group A and Group B (patients with medulloblastoma having annotations colored according to the corresponding cell types (chi-square test).B: The correlation between microenvironmental cell types based on cell type-related gene scores.图6 肿瘤微环境细胞在肿瘤发生过程中的共同作用

表2 多因素COX风险模型分析星形胶质细胞和少突胶质细胞相关基因得分与髓母细胞瘤患者OS期的关系Table 2 MultivariateC OX proportional-hazards model analysis of the relationship between astrocyte-and oligodendrocyte-related gene scores and the overall survival (OS) of patients with medulloblastoma

3 讨论

髓母细胞瘤是儿童中最常见的中枢神经系统肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的16%～25%[26]。目前治疗髓母细胞瘤的方式首选手术治疗，术后辅以放化疗。然而过度放、化疗对儿童其他器官的损害极大，肿瘤远期生存率仍然很差[27]。所以，探索影响髓母细胞瘤发生和发展的机制，以寻求新的治疗方向，显得尤为迫切。

许多研究已经表明，肿瘤微环境细胞在肿瘤的发生和发展过程中起着重要作用。SHARMA等[28]发现，肝癌中肿瘤相关性巨噬细胞可通过分泌细胞因子等方式与肿瘤细胞相互作用，从而拮抗肿瘤的生长。然而，小胶质细胞作为中枢神经系统中主要的巨噬细胞群，其对肿瘤发生和发展的影响仍存在争议[18]。其他研究表明，肿瘤微环境细胞可预测肿瘤对治疗的敏感性。GOODEN等[19]发现，当肿瘤浸润性淋巴细胞如CD3＋T细胞的比例增加时，患者的预后更好，提示这些患者对治疗更敏感。MAYNARD等[29]发现，化疗敏感的肺癌患者中，T细胞的比例高于化疗耐受的患者，提示T细胞的存在可改善患者的预后。因此，靶向干预肿瘤微环境细胞可能有助于抑制肿瘤的进展，改善肿瘤患者的预后。

本研究通过对正常小鼠和肿瘤小鼠微环境的scRNA-seq数据的整合分析，首次描述了髓母细胞瘤小鼠模型中可能存在的微环境细胞类型，并首次比较了肿瘤和正常小鼠、肿瘤小鼠治疗组和对照组之间微环境细胞的数量变化。随后分析微环境细胞相关基因表达水平和患者预后的关系，发现成纤维细胞和小胶质细胞在肿瘤微环境中的富集可改善患者的预后。此外，患者的临床特征分组也显示，富集这2类细胞的分组患者预后更好，结合细胞相关性分析结果，提示这两类细胞可能起到共同抑制肿瘤进展的作用。已有研究表明[30]，成纤维细胞可增强膀胱癌细胞的增殖和转移能力，从而促进膀胱癌的进展。而本研究结果显示，成纤维细胞可改善髓母细胞瘤患者的预后，多因素COX风险模型进一步显示成纤维细胞相关基因表达水平及肿瘤不发生转移均为患者OS期的保护因素，可见成纤维细胞可能阻碍髓母细胞瘤发生转移，从而抑制其进展。作为小脑中巨噬细胞的主要类型，小胶质细胞与肿瘤相关性巨噬细胞的作用一致，即能够抑制肿瘤的发生和发展。本研究还发现少突胶质细胞的存在，可导致患者的预后较差，并促进肿瘤的转移，这在以往的报道中较少出现。

近年来有关髓母细胞瘤的scRNA-seq研究已经详细地描述了肿瘤细胞之间的异质性，并通过结合患者RNA表达数据分析，阐明了不同肿瘤细胞分群对患者预后的影响[15-16]。然而，是这些研究都忽视了对微环境细胞的分析，因此本研究首次利用小鼠scRNA-seq数据着重探讨微环境细胞在不同状态下的数量变化，包括比较肿瘤和正常小鼠、肿瘤小鼠治疗组和对照组的细胞数量变化的情况。为了进一步研究不同微环境细胞分群对患者预后的影响，本研究还从GEO数据库（GSE124814）中下载了整合23个数据集中共405例SHH型髓母细胞瘤患者的RNA表达数据及临床资料进行分析，最终结果提示成纤维细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞对患者预后有显著影响，表明这3类细胞在髓母细胞瘤的靶向干预治疗中具有重要意义，但关于这3类细胞调控髓母细胞瘤发生和发展的具体功能和机制还有待进一步探讨。

综上所述，肿瘤微环境中的成纤维细胞和小胶质细胞可改善患者的预后，抑制髓母细胞瘤的发生和发展；而少突胶质细胞可使患者的预后更差，促进髓母细胞瘤的进展。因此，靶向干预这3类细胞对肿瘤细胞的调控机制，可能有助于抑制肿瘤的进展，改善肿瘤患者的预后。