外周血LncRNA MIR155HG、miR-155检测在肺结核筛查中的临床价值

李君莉，赵慧姝

(成都市公共卫生临床医疗中心呼吸科，成都 610066)

肺结核是一种由结核分枝杆菌引发的疾病，当结核分枝杆菌感染机体后，若机体免疫功能低下，潜伏结核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)可进展为活动性肺结核(active tuberculosis, ATB)[1]。目前研究认为，肺结核发生、发展不仅与免疫炎症反应有关，还与长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)、微小RNA(microRNA, miRNA)等异常表达相关[2]。研究表明，微小RNA-155(microRNA-155, miR-155)在肺结核患者外周血中呈过表达，且可能影响肺结核疾病的进程[3]。另有学者发现，LncRNA MIR155宿主基因(lncRNA MIR155 host gene, LncRNA MIR155HG)在肺纤维化中表达上调，其可能参与肺纤维化过程[4]。本研究旨在检测LncRNA MIR155HG、miR-155在ATB患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的表达水平，分析LncRNA MIR155HG、miR-155之间的相关性，评估二者对ATB的临床筛查价值及其与预后的关系，以期为临床诊治ATB、评估病情及预后提供依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2017年6月至2020年7月阿坝藏族羌族自治州人民医院感染科收治的130例肺结核患者作为肺结核组，其中男72例，女58例，年龄(44.11±9.72)岁；体质指数(body mass index, BMI)为(17.00～24.81)kg/m2，平均BMI为(20.99±2.83)kg/m2；其中活动性肺结核(ATB)患者56例(ATB组)、潜伏结核感染(LTBI)患者74例(LTBI组)。纳入标准：(1)均符合《肺结核诊断和治疗指南》[5]中相关肺结核诊断标准；(2)病历资料齐全；(3)ATB患者至少满足：有活动性病灶、结核中毒症状、痰液检测抗酸染色阳性1次及以上中的2个条件；(4)LTBI患者结核感染T细胞检查为阳性，与ATB高危人群接触密切，其细菌学、X线胸片检查为阴性，无肺结核临床症状。排除标准：(1)合并高血压、恶性肿瘤、糖尿病者；(2)妊娠、哺乳期女性；(3)合并丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、使用免疫抑制药物者；(4)伴有精神障碍者。治疗方案：ATB患者接受标准化抗结核治疗[5]。疗效评价：ATB患者接受6个月治疗后，若临床症状消失，痰涂片阴性，胸片正常定义为治愈(治愈患者35例，治愈组)，否则为未治愈(未治愈患者21例，未治愈组)。选取同期本院体检健康者134例作为健康人对照组，其中男71例，女63例；年龄(44.87±9.96)岁；BMI为(17.07～25.02)kg/m2，平均BMI为(21.13±2.97)kg/m2。健康人对照组、肺结核组性别构成比例、BMI、年龄比较，差异无统计学意义(χ2/t分别为0.153、0.392、0.627，P分别为0.696、0.695、0.531)。本研究经阿坝藏族羌族自治州人民医院医学伦理委员会批准(批准文号：17005-16)，患者及家属知情同意。

1.2试剂与仪器 人外周血Ficoll淋巴细胞分离液(上海善然生物科技公司)，TRIzol试剂(南京森贝伽生物科技公司)，miRNA提取试剂盒(北京智杰方远科技公司)，逆转录试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit，北京鼎国昌盛生物技术公司)，宝生物染料法荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，美国TaKaRa公司)，miRNA荧光定量试剂盒(美国GeneCopoeia公司)。NanoDrop One超微量紫外分光光度计(北京龙跃生物科技发展公司)，SLAN-96P实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技公司)。

1.3标本采集 收集所有肺结核患者入院当日(治疗前)及体检健康者体检时的清晨空腹外周血5～6 mL，置于含有肝素的抗凝采血管中，使用Ficoll淋巴细胞分离液，按密度梯度离心法分离获得PBMC，PBS冲洗3次，置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆转录反应 取上述各研究对象约3×106个PBMC，使用TRIzol试剂抽提总RNA，NanoDrop One超微量紫外分光光度计检测RNA样本吸光度(A)值，取A260 nm/A280 nm值为1.8～2.0的样本用于后续试验。RNA样本置于-80 ℃保存。按照逆转录试剂盒说明书操作将2 μL RNA样本逆转录为cDNA，样本置于-20 ℃保存。

1.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155表达水平 LncRNA MIR155HG以GAPDH为内参，miR-155以U6为内参，引物序列由上海生工公司使用OligoArchitect 软件设计并合成。各引物序列见表1。按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ说明书进行PCR扩增。LncRNA MIR155HG的qRT-PCR反应体系为20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各0.7 μL，cDNA 2.0 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)8.5 μL，ddH2O 8.1 μL。循环参数：97 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 60 s，共40个循环。miR-155的qRT-PCR反应体系为20 μL，包括cDNA 2.0 μL，FastStart Universal SYBR Green Master 8.5 μL，10 μmol/L上、游引物各0.8 μL，ddH2O 7.9 μL。循环参数：97 ℃ 8 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 50 s，共40个循环。LncRNA MIR155HG于62 ℃时，miR-155于60 ℃时使用High Resolution Melting Software v3.0.1软件采集荧光信号，并分析熔解曲线。采用2-△△Ct法计算LncRNA MIR155HG及miR-155的表达水平。试验重复3次。

表1 LncRNA MIR155HG、miR-155及内参GAPDH、U6的引物序列

2 结果

2.1各组PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155水平比较 肺结核组患者PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表达水平[(1.78±0.57)、(1.65±0.54)]显著高于健康人对照组[(1.02±0.32)、(1.01±0.33)]，差异有统计学意义(t分别为13.410和11.658，P均<0.05)。进一步进行不同类型肺结核患者间的比较，结果发现ATB组患者PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表达水平[(2.02±0.68)、(1.90±0.63)]亦显著高于LTBI组[(1.55±0.53)、(1.41±0.46)]，差异有统计学意义(t分别为4.430和5.127，P均<0.05)。未治愈组ATB患者PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表达水平[(2.34±0.78)、(2.15±0.72)]显著高于治愈组[(1.83±0.61)、(1.75±0.58)]，差异有统计学意义(t分别为2.725和2.280，P均<0.05)。

2.2ATB、LTBI组患者PBMC中LncRNA MIR155HG与miR-155的相关性 Pearson法分析显示，ATB、LTBI组患者PBMC中LncRNA MIR155HG的表达水平均与miR-155呈正相关(r分别为0.461、0.397，P均<0.05)。

2.3PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表达水平对ATB的筛查价值 以ATB患者为疾病组，LTBI患者、健康者为对照组，依据2组PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表达水平绘制ROC曲线，结果见图1。LncRNA MIR155HG、miR-155筛查ATB的曲线下面积(AUCROC)分别为0.824、0.843；二者联合筛查ATB的AUCROC为0.917，其敏感性、特异性分别为89.3%、82.4%。见表2。

表2 PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155表达水平对ATB的筛查价值

图1 PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155筛查ATB的ROC曲线

3 讨论

miR-155与肺结核发生、发展关系密切。本研究中肺结核患者PBMC中miR-155的表达水平较高，ATB患者miR-155的表达水平更高，与Kathirvel等[6]、时广利等[7]的研究趋势相符，提示miR-155可能在肺结核病变进程中发挥重要调节作用，检测PBMC中miR-155的表达水平有利于判断患者病情进展。然而，miR-155在ATB患者PBMC中的表达水平及其筛查价值仍不明确。本研究证实患者PBMC中miR-155筛查ATB的AUCROC为0.843，当miR-155>1.72时，ATB发生风险较大，miR-155可作为筛查ATB的辅助指标。推测高表达miR-155可能通过影响机体免疫应答，调节相关信号转导，促进机体炎症反应，进而影响肺结核发生、发展，但具体机制有待深入研究证实。

本研究结果显示，LncRNA MIR155HG在肺结核患者PBMC中的表达水平较高，与其在慢性阻塞性肺疾病、非小细胞肺癌中的趋势一致，且其在ATB患者中升高更甚，提示LncRNA MIR155HG可能在肺结核发生、发展中具有重要作用。检测PBMC中LncRNA MIR155HG的表达水平有助于评估患者病情，究其原因，高水平LncRNA MIR155HG可能通过加重机体炎症反应，影响免疫调节，从而影响肺结核发病进程，但尚需进一步机制研究证实。笔者通过进一步研究显示，PBMC中LncRNA MIR155HG筛查ATB的AUCROC为0.824，当PBMC中LncRNA MIR155HG相对表达量>1.81时，ATB发生几率较高，提示LncRNA MIR155HG对ATB有一定的筛查价值，可辅助筛查ATB。

LncRNA MIR155HG/miR-155轴可能为治疗非小细胞肺癌提供新的治疗策略。本研究发现ATB患者PBMC中LncRNA MIR155HG的表达水平与miR-155呈正相关，提示LncRNA MIR155HG可能与miR-155相互影响，进而共同影响ATB发生、发展。进一步研究发现，PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155联合筛查ATB的AUCROC为0.917，敏感性为89.3%，均高于二者单独检测，且特异性为82.4%，提示二者联合可在一定程度上增加对ATB的筛查价值，有助于临床更好地筛查ATB患者。此外，本研究还发现未治愈的ATB患者PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表达水平较高，提示LncRNA MIR155HG、miR-155可能与ATB预后有关，测定PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表达可能有利于判定ATB患者是否转归。

本研究尚存在一定局限性：(1)研究样本较少，筛查、预后相关结果有待扩大样本量进行验证；(2)LncRNA MIR155HG、miR-155在ATB中的具体机制未深入探究，后续需结合基础及临床实验进一步验证，为临床诊治ATB提供有力证据。

致谢：感谢阿坝藏族羌族自治州人民医院感染科对本研究给予的支持！