应用流式细胞术辅助诊断神经母细胞瘤患儿骨髓侵犯

邢天禹，陈慧，高超，陈振萍，贺思豆，苏雁，马晓莉

(国家儿童医学中心，首都医科大学附属北京儿童医院 a.血液病中心，儿童血液病与肿瘤分子分型北京市重点实验室，儿科学国家重点学科，儿科重大疾病研究教育部重点实验室，北京市儿科研究所，血液疾病研究室，b.儿童肿瘤中心肿瘤内科，北京市儿童血液肿瘤重点实验室，儿科重大疾病研究教育部重点实验室，北京 100045)

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是一种起源于交感神经系统的恶性实体肿瘤，起病隐匿，易发生转移。骨髓(bone marrow，BM)是NB最常见的转移部位之一，患者预后较差[1-2]。骨髓细胞形态学结果是判断NB骨髓转移的金标准。近年来，随着对NB标志物的深入研究，检测方法逐渐丰富。有学者采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测配对同源异型盒蛋白2B(paired like homeobox 2B，PHOX2B)基因的表达[3]，证实其可以特异性高表达于神经源性细胞内，且在骨髓样本中的检测灵敏度可达10-5数量级，但同时存在操作过程复杂，对操作人员要求较高，易出现污染等问题，无法满足临床的迫切需求。

流式细胞术(flow cytometry assay，FCM)是一种快速、便捷的临床常规检测技术[4]。神经节甘脂(ganglioside 2，GD2)作为神经母细胞瘤表面特异性标志物和治疗靶点[5]，近年来多项研究应用以标记GD2为主的多色组合方案FCM进行GD2检测。然而，相关研究的检测准确率均不同，且在大样本量的儿童临床检测应用中的相关报道较少[6-7]。目前，对NB细胞的标记方案尚无统一标准。本研究拟采用CD45/CD56/CD81/GD2四色组合方案的FCM检测120例NB初诊患儿的骨髓样本，并与骨髓细胞形态学结果进行比对，以期为临床提供快捷、准确的检测方法。

1 材料和方法

1.1研究对象 连续纳入2019年6月至2020年6月首都医科大学附属北京儿童医院肿瘤内科收治且确诊的NB患儿，男64例，女56例，年龄2～187个月，中位年龄34.5个月。其中低危组33例，中危组38例，高危组49例。患儿诊断时行骨髓细胞学检查，包括骨髓涂片和骨髓活检免疫组化检测，其中1项或全部结果阳性即可诊断为骨髓侵犯。患儿存在骨髓侵犯37例，无骨髓侵犯83例。NB诊断标准依据国家卫生健康委员会《儿童神经母细胞瘤诊疗规范》2019版[8]。纳入标准：(1)病理诊断：肿瘤组织光镜下明确诊断为NB；(2)临床诊断：骨髓涂片或骨髓活检显示特征性NB细胞，伴有尿液(或血清)儿茶酚胺或其代谢产物明显升高。具有以上任何1条即可入组。排除标准：对患严重的肝肾疾病，血液系统疾病，其他恶性肿瘤，自身免疫病以及经化疗、放疗或免疫治疗的患儿予以排除。本研究经首都医科大学附属北京儿童医院医学伦理委员会批准(伦理文号：2017-k-54、2017-114)，并进行临床注册(注册号：ChiCTR1800017940，2018-1-1)。NB患儿家属均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 Peridinin叶绿素蛋白(PerCP)标记小鼠抗人CD45抗体、R-藻红蛋白(PE)标记小鼠抗人CD81抗体(美国Miltenyi Biotec公司)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记小鼠抗人GD2抗体、溶血素(美国BD公司)，异藻蓝蛋白(APC)标记小鼠抗人CD56抗体(美国Beckman coulter公司)，高pH值抗原修复液、过氧化氢酶阻断剂、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体、DAB显色液、兔抗人Protein Gene Product 9.5抗体(protein gene product 9.5，PGP9.5)、兔抗人突触素抗体(synaptophysin，Syn)、兔抗人嗜铬素A抗体(chromogranin A，CgA)均购自北京基因科技公司，苏木素染液、伊红染液、分化液、返蓝液(北京九州柏林生物科技公司)，瑞氏染色剂(珠海BASO公司)。NAVIOS流式细胞仪、Kaluza分析软件(美国Beckman coulter公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 NB患儿在诊断初期，于髂骨位置取骨髓液制作至少2张骨髓涂片。另采集2 mL骨髓液置于肝素抗凝管中，迅速颠倒混匀，2 h内进行FCM检测。相同部位取直径2 mm，长度1.5～2.5 cm的骨髓组织，外观可见白色的骨皮质和红色的骨髓质，置于10%福尔马林固定液中保存。

1.3.2FCM 取上述各NB患儿的骨髓样本，分别设立1个对照管和1个试验管，各管分别加入PerCP标记小鼠抗人CD45抗体10 μL、APC标记小鼠抗人CD56抗体5 μL，对照管加入对照试剂1 μL，FITC标记小鼠抗人IgG1和2 μL APC标记小鼠抗人的IgG1，试验管加入2 μL FITC标记小鼠抗人GD2抗体和1 μL APC标记小鼠抗人CD81抗体。各管分别加入150 μL骨髓样本，震荡混匀，室温避光温育20 min。每管加入溶血素工作液(1∶9稀释)2 mL，振荡混匀，避光静止10 min。700×g离心5 min，弃去上清，加入2 mL PBS震荡混匀。重复离心，PBS洗涤2次，弃去上清，加入150 μL PBS，24 h内上机检测。利用前向角散射光(FSC)设门去除粘连细胞，以CD45和CD56设门圈出CD45-CD56+细胞群，再以CD81和GD2设门圈出CD81+GD2+细胞群(NB细胞)。采用Kaluza流式细胞仪分析软件分析细胞免疫表型，以CD45阴性、CD56阳性、CD81阳性、GD2阳性的细胞群定义为NB细胞，并计算NB细胞在全部有核细胞中所占的百分比。

1.3.3骨髓细胞形态学

1.3.3.1骨髓涂片检测 每例患者取至少2张骨髓涂片，瑞-吉氏染色后镜检。常规计数200个有核细胞，以观测到异常菊花团样肿瘤细胞定义为NB骨髓侵犯。涂片采用HE染色，经二甲苯和梯度乙醇(100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇)脱蜡、脱水。苏木素染色5 min。常规透明、脱水、封片后镜检。

1.3.3.2骨髓免疫组化检测 骨髓标本用10%福尔马林固定液固定、石蜡包埋，切成4 μm厚切片，经二甲苯和梯度乙醇(100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇)脱蜡、脱水，PBS洗涤3次，每次5 min。切片在抗原修复液中高压、煮沸5 min以修复抗原。湿盒内加入内源性过氧化氢酶阻断剂避光温育15 min，以抑制内源性过氧化物酶活性。PBS洗涤3次，每次5 min。加入兔抗人PGP9.5、CgA、Syn一抗工作液(1∶200稀释)置于湿盒中温育50 min，PBS漂洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(1∶1 000稀释)，室温温育20 min，PBS漂洗3次，滴加3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色液，苏木素复染、透明、常规脱水、封片。以PBS替代一抗作为阴性对照。每张切片选取5个高倍镜视野(×400)，以显色为褐色的细胞为阳性细胞。

1.4统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，一致性分析采用Kappa检验，以P<0.05为差异有统计学意义，以Kappa≥0.80为两者一致性强。

2 结果

2.1FCM检测与骨髓活检结果的比较 骨髓细胞形态学结果阳性为37例，阴性83例；FCM结果阳性35例，阴性85例。骨髓活检及骨髓免疫组化检测结果见图1、2。FCM检测结果见图3。

注：A,NB骨髓侵犯；B,无NB骨髓侵犯(HE染色，×400)。

2.2FCM检测与骨髓活检结果的一致性评价 细胞形态学阳性组FCM检测的准确率为91.8%(34/37)。细胞形态学阴性组FCM检测的准确率为98.7%(82/83)。见表1。FCM检测结果和骨髓细胞形态学检测结果的一致性较强(Kappa=0.921，P<0.001)。

表1 120例NB患儿FCM检测与骨髓细胞形态学结果的一致性评价

3 讨论

FCM是临床检验重要的技术之一，其优势在于操作便捷，灵敏度可达0.01%[9-10]。Nagai等[11]发现，在NB细胞膜上CD81的表达水平高于CD9，应用CD45/CD56/CD81方案比CD45/CD56/CD9方案标记NB更具有特异性和灵敏性。虽然CD81在NB细胞上呈强阳性表达，但其研究可能存在漏洞，本研究发现在明确无骨髓转移样本中均有CD81的表达，因此，单独使用CD45/CD56/CD81方案在临床检测中是不可行的。汤永民等[6]应用CD45/CD56/GD2方案检测结果显示，13例初诊病例的骨髓检测结果与病理检查诊断结果的符合率达92%。Manenq等[10]采用CD45/CD56/GD2/CD81/CD9/CD90多色方案检测45例NB样本，结果证实，其与免疫组织化学结果比较的准确率为80%。然而，该方案需采用多种标记，在操作时需要设立多个对照管，难以应对大量的待检测样本。目前，对NB细胞的标记方案尚无统一标准。

本研究采用CD45/CD56/CD81/GD2四色方案的FCM,利用特异性高的CD81和GD2抗体标记NB细胞，更有利于临床检测。本研究结果显示，37例初诊伴有NB侵犯的FCM结果与骨髓细胞形态学结果的符合率为91.8%，与文献[6]结果基本一致，进一步证实了该方案的准确性。82例无NB侵犯的FCM结果与骨髓细胞形态学结果的符合率为98.7%，其中1例形态学阴性，但FCM阳性的患儿结合基因结果考虑NB低程度浸润，也提示该方案具有较高的检测灵敏度。

综上所述，CD45/CD56/CD81/GD2四色组合方案的FCM能够快速检测NB骨髓侵犯，具有良好的特异性和灵敏度。然而，本研究仅入组诊断初期的NB患儿，未对在治疗过程中的患儿骨髓进行评估，还需要后续研究以进一步分析。