纤维素降解菌株的分离与筛选*

赖国栋 秦长生 赵丹阳 邱华龙 杨 华 田龙艳 练 涛 徐金柱

（广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520）

纤维素是地球上含量多、分布广的可再生资源，其以木质纤维形式存在，主要由纤维素、半纤维素和木质素构成[1]，其主要来源于高等植物[2]。纤维素以其独特的化学结构在自然界难以被降解[3]。目前纤维素的降解主要有物理法、化学法和生物法3 种方法，生物法相比其它两种方法，具有安全性高、能耗低、经济环保等优势[4]，逐渐被人们重视。生物法降解纤维素，主要依靠纤维素酶，自从1906 年Seilliere 首次在蜗牛肠胃消化液中发现的纤维素酶能降解纤维素以来[5]，纤维素酶就引起了国内外研究人员重视。

纤维素酶的来源相当广泛，但目前仍然以产酶微生物为主，自1912 年Pringsheim 等人成功从土壤中筛选出第一批纤维素降解菌以来[6]，至今已从不同环境中分离获得超过200 种可以产纤维素酶的微生物，其中不乏具有耐低温、耐高温、耐碱等特殊功能的微生物[7-10]。纤维素降解菌主要有真菌、细菌和放线菌，真菌产纤维素酶多为胞外酶，细菌产纤维素酶多为胞内酶，放线菌因产酶量低于真菌和细菌研究相对较少[11-12]。在我国绿化垃圾种类繁多，其主要成分以木质纤维素为主[13-19]，但我国对纤维素的利用水平相对较低，本研究旨在筛选出能高效生产纤维素酶的菌株并鉴定，为提高我国纤维素利用率提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 土样及菌株来源

土样采自广东省林业科学研究院枯枝落叶堆腐的土壤；菌株：木腐菌7 株，保存于广东省林业科学研究院。

1.2 培养基

（1）富集培养基：羧甲基纤维素钠（CMCNa）15 g，硝酸铵（NH4NO3）1 g，酵母膏1 g，七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）筛选培养基：羧甲基纤维素钠（CMCNa）20 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）2 g，七水硫酸 镁（MgSO4·7H2O）0.3 g，硫 酸 铵(NH4)2SO41.4 g，氯化钙（CaCl2）0.3 g，氯化锌（ZnCl2）0.001 7 g，硫酸锰（MnSO4）0.001 6 g，氯化钴（CoCl2）0.002 g，硫酸亚铁（FeSO4）0.000 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0～7.2。

（3）发酵产酶培养基：蛋白胨3 g，硫酸铵2 g，酵母膏0.5 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）4 g，氯化钙（CaCl2）0.3 g，七水硫酸镁（Mg-SO4·7H2O）0.3 g，Tween-80 0.2 mL，羧甲基纤维素钠（CMC-Na）20 g，蒸馏水1 000 mL。

（4）SDY 培养基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖40 g，蒸馏水1 000 mL。

（5）LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠（NaCl）10 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3 主要试剂

（1）1 mg/mL 刚果红溶液：称取0.5 g 刚果红，加蒸馏水溶解并定容至500 mL，室温、避光保存。

（2）1 mol/L 氯化钠溶液：称取58.5 g NaCl,加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL。

（3）1.0 mg/mL 葡萄糖标准液：称取烘干至恒重的葡萄糖0.10 g，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，4 ℃保存。

（4）柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液（0.05 mol/L，pH4.5）：A 液：称取柠檬酸10.507 g 用蒸馏水溶解后定容至500 mL；B 液：称取柠檬酸三钠14.705 g 用蒸馏水溶解后定容至500 mL；取230 mL A 液和270 mL B 液混合后即为柠檬酸缓冲液。

（5）DNS 试剂：称取6.3 g 3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7），21 g 氢氧化钠（NaOH），182 g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O），5 g 苯酚（C6H5OH）（在50 ℃水溶化），5 g 偏重亚硫酸钠（NaS2O5），搅拌至完全溶解，定容至1 000 mL,避光储存于棕色试剂瓶中，4 ℃保存，放置一周后使用。

（6）1% CMC-Na：称取1.0 g CMC-Na 溶解于100 mL 柠檬酸缓冲液中，4 ℃保存。

（7）DNA 提取试剂盒：M5 Fungal Genomic DNA Kit（50T）。

（8）菌株保存液：30%甘油与无菌水1:1 混合。

1.4 主要实验仪器

超净工作台、水浴锅、紫外分光光度计、搅拌器、高压灭菌锅、PCR 仪、pH 计、离心机、振荡器、电子天平、恒温振荡培养箱等。

1.5 富集培养

将采集的土壤过筛处理，称取土样10 g，放入装有100 mL 富集培养基的250 mL 三角瓶中，加入3 颗无菌玻璃珠，30 ℃，150 rpm 振荡培养3～4 d[9-10]。

1.6 菌株分离

取1 mL 富集培养液，梯度稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6共6 个梯度浓度，每个梯度各取0.1 mL，涂布于筛选培养基平板上，30 ℃培养，每个浓度涂布10 块板。待菌落长出后，挑选不同形态的菌株划线，获得单菌株，纯化菌株[9-10]。

1.7 纤维素降解能力测定初筛（刚果红染色法）

分别将纯化得到的菌株和实验室保存的7 株木腐菌点接到筛选培养基平板中央，每菌株3 个重复，30 ℃恒温培养3～6 d，根据菌落生长速度确定染色时间（菌落直径不超过培养皿半径前进行染色）。取1 mg/mL 刚果红溶液3 mL，均匀布于平板，染色30 min，用1 mol/L 氯化钠溶液冲洗30～60 min，利用十字交叉法测量菌落直径d（mm）和菌落外围透明圈直径D（mm），根据Hc值（Hc=D/d），确定供试菌株分解纤维素能力，筛选比值较大的菌株，进行酶活测试[9-10]。

1.8 CMC 酶活测定复筛（DNS 法）

1.8.1 粗酶液的制备 将初筛目标菌株接种至种子培养基（SDY 培养基），28 ℃，180 rpm 培养3 d，按10%接种量接种至装有100 mL 发酵产酶培养基的三角瓶中，每株菌设3 个重复，28 ℃，180 rpm培养5 d，取10 mL 发酵液，4 ℃，5 000 rpm 离心10 min，所得上清液即为粗酶液[9-10]。1.8.2 标准曲线绘制 参考相关文献[19]，绘制葡萄糖标准曲线。取一系列25 mL 具刻度试管并进行标号，根据表1 内容依次加入葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS 溶液。混匀后，沸水浴10 min，迅速冷却加蒸馏水定容至 25 mL，在540 nm 波长下，以1 号管调零测量各管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

表1 葡萄糖标准曲线绘制Table 1 Draw a standard curve of glucose

1.8.3 纤维素酶（CMCase）活力测定 取4 支25 mL试管，设置1 个空白对照管和3 个试验管分别加入1 mL 粗酶液，将空白对照管进行沸水灭活10 min，试验管不作沸水灭活处理。然后4 支试管均加入1.5 mL 1% CMC-Na，混匀，50 ℃保温30 min 后沸水浴灭活10 min。再分别加入3 mL DNS 溶液沸水浴反应10 min 后迅速冷却，加蒸馏水定容至25 mL，于540 nm 波长下，以空白对照管调零，测定试验管的OD 值，并计算酶活力。

酶活力定义：在50 ℃条件下，1 mL 粗酶液1 min 产生1 μg 葡萄糖为一个酶活单位，用U/mL表示。酶活计算公式如下：

酶活力E=1 000×S×N/(T×V)

其中，E： 样品的酶活力( U/mL) ；S：由样品的平均吸光值在标准曲线上相对应的葡萄糖含量(mg) ；N：粗酶液的稀释倍数；1 000：mg 与 μg之间的换算倍数；T： 反应时间( min) ；V： 参与反应的粗酶液体积( mL)[9-10]。

1.9 高产酶菌株的鉴定

采用M5 Fungal Genomic DNA Kit（50T）试剂盒提取供试菌株总DNA，并以此为模板进行PCR 扩 增 分 析。以ITS1/ITS4 和ITS4/ITS86 为引物，进行 PCR 扩增（表2）。扩增体系为25 μL（Premix Taq 12.5 μL，DNA 模 板2 μL，引 物0.5 μL，ddH2O 15 μL）。扩增条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，循环32次；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。细菌以27F/1492R和357F/907R 为引物进行 PCR 扩增。扩增条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸90 s/30 s，循环32 次；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物送上海生工生物工程公司测序。测序结果在NCBI 上进行同源性比较和聚类分析，确定菌株种类[9-10]。

表2 高产酶菌株鉴定所用引物Table 2 Primers for strain identification

2 结果与分析

2.1 菌株分离

从同一批次土壤中挑选1～2 株培养性状（菌落形态、生长速率、色素分泌等）差异显著的菌株进行分离纯化。经富集培养分离，从3 批腐殖质土壤中共分离获得47 个菌株（表3）。

表3 土壤微生物形态特征Table 3 Morphological characteristics of soil microorganisms

2.2 纤维素降解性能测试初筛

采用刚果红染色法对土壤中分离的47 株菌和实验室保存的7 株木腐菌进行纤维素降解能力测试。结果表明：供试菌株对纤维素钠的降解能力存在明显差异（Hc = 0-3.87），根据Hc 的大小，最终将供试菌株分为高产酶、低产酶、不产酶3 类。再次利用刚果红染色，筛选出Y2、Y5、Y6 和 HF-3 共4 个菌株菌落外围形成较大透明圈，Y5 的Hc 值最大，为3.87；Y2 的次之，Hc 值为2.54；Y6 的Hc 值1.86；HF-3 的生长速率最快，Hc = 1.35。初步筛选出Y2、Y5、Y6 和 HF-3 高产纤维素酶的菌株共4 株（图1、表4）。

表4 高产纤维素酶菌株的Hc 值Table 4 Hc value of high cellulase producing strain

图1 高产纤维素酶的菌株刚果红染色结果Fig. 1 Congo red staining results of high cellulase producing strain

2.3 纤维素降解菌株酶活测定复筛

试验以葡萄糖含量为横坐标，OD 值540 nm的吸光度为纵坐标，绘制的葡萄糖标准曲线如图2 所示，线性回归方程为：y=0.902 1x+ 0.090 4（R2=0.958 5），拟合效果良好，可用于酶活测定。

图2 葡萄糖标准曲线Fig. 2 Glucose standard curve

将初筛获得的4 株高产纤维素酶菌株在28 ℃，180 rpm 发酵培养5 d，测定各菌株CMC酶活力。菌株HF-3 的CMC 酶活力最高，为67.722 U/mL；其次为菌株Y5，为37.714 U/mL；菌株Y6，为30.694 U/mL；菌株Y2 的CMC 酶活力最低，为25.336 U/mL（表5）。

表5 高产纤维素酶菌株CMC 酶活力Table 5 CMC enzyme activity of the strain

2.4 菌株鉴定结果

通过分离纯化，培养4 个菌株的菌落特征（生长速率、菌落质地、颜色、气味）等特征，初步 确 定Y2、Y5、Y6 为 放 线 菌(Actinomycete)，HF-3 为真菌，菌落形态如图3 所示。

图3 高产纤维素酶菌株菌落形态Fig. 3 Morphological characteristic of strain

采用试剂盒提取菌株DNA，分别以各菌株DNA 为模板进行PCR 扩增。扩增产物送上海生工生物工程公司测序，利用SeqMan 进行序列拼接剪切，将结果输入NCBI 网站，进行同源性比对，同时下载同源序列，利用MEGA7 构建系统发育树（图4～7），确定菌株种类，具体鉴定结果如表6所示，HF-3 为密褐褶孔菌Gloeophyllum trabeum，Y5 为浅灰白链霉菌Streptomyces griseoloalbus、Y6 为丝状链霉菌Streptomyces filamentosus和Y2为威德摩尔链霉菌Streptomyces wedmorensis。

表6 纤维素降解菌种类Table 6 The specie of cellulose degrading strain

图4 Y2 系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of Y2

3 结论与讨论

在自然界中的纤维素主要靠细菌、放线菌、真菌都产生的孢外纤维素酶进行降解，而高效降

解菌株的筛选是纤维素开发和利用的关键，本研究利用羧甲基纤维素钠培养基和刚果红透明圈染色法，从土壤和实验室已有的木腐菌种中初步筛选出4 株较高产酶的纤维素降解菌株，4 株菌株在28 ℃、180 r/min 条件下培养5 d 后，孢外纤维素酶活性HE-3 菌株最高为67.772 U/mL，其它3 个菌株相对较高，Y5 为37.714 U/mL、Y6 为30.694 U/mL、Y2 为25.336 U/mL。通 过 菌 落 特征以及DNA 分子比对，对4 株菌株进行了鉴定，HF-3 为密褐褶孔菌，Y5 为浅灰白链霉菌、Y6 为丝状链霉菌和Y2 为威德摩尔链霉菌。

图5 Y5 系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree of Y5

图6 Y6 系统发育树Fig. 6 Phylogenetic tree of Y6

图7 HF-3 系统发育树Fig. 7 Phylogenetic tree of HF-3

邵帅等[20]研究发现，在不同的培养基中，菌株产生的纤维素酶的活性存在差异，因此优化产酶条件是提高纤维素降解率的关键。Kato 等[21]研究表明 CSK1 单独培养后进行木质纤维素降解时，其效率显著低于混合菌系；夏强[22]对3 株具有木质纤维素降解功能的菌株进行复配后得到的复合菌剂，对小麦秸秆中纤维素的降解率达到63.59%；由此可知复配是提高菌株降解的另一途径。受此启发，本研究后续将对4 个菌株的产酶条件进行优化，获得高效产酶条件，并将4 个菌株进行复配研究，进一步提高其对纤维素的降解能力。