高毒力肺炎克雷伯菌和普通肺炎克雷伯菌耐药性检测

孙运芳，邢 薇，曹淑祯，孙淑红

(1山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2临沂市人民医院)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是医院感染最常见的革兰阴性菌之一，也是容易引起多重耐药性的细菌之一。目前多项研究一致认为，其耐药机制与产生碳青霉烯酶、AmpC酶、超广谱β内酰胺酶(Extended spectrum beta lactamases，ESBLs)以及外膜孔蛋白(Omp)缺失、外排泵等有关[1-4]。其耐药性可以借助质粒、转座子、整合子的播散，导致临床耐药菌株增多，对临床KP的防治带来极大的难度。KP有普通KP(Classic klebsiella pneumonia，cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(Hypervirulent klebsiella pneumoniae，hvKP)两种类型，与cKP相比，hvKP致病力强，对病人的危害大，本研究回顾性分析了近几年来病人感染的hvKP和cKP的耐药特点，为临床治疗及预防耐药菌的传播提供借鉴。

1 材料与方法

1.1菌株来源 回顾性收集2015年1月—2018年12月临沂市人民医院分离的KP 87株，来自87例患者静脉血和穿刺液等标本，其中男87人，女40人，年龄19～81岁，平均(54.12±12.90)岁。入组标准：患者标本细菌培养出KP，同时身体其他部位一个或多个部位有感染表现。排除标准：标本中检测到KP，但感染时间短，不明确与感染的相关性；多种细菌混合型感染。科室分布：消化内科19株(占22.35%)，其次为血液科12株(占14.12%)、急诊科中部分有基础疾病的病人合并感染者9株(占10.59%)、心外科6株(占7.06%)、烧伤科5株(占5.88%)、神经内科5株(占5.88%)及部分其他科室。

1.2方法 采用常规生化试验、药敏试验及毒力基因鉴定，结合VitekⅡ全自动细菌鉴定仪进行鉴定，个别细菌经过质谱仪确认。

1.2.1药物敏感实验 质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922(购自卫生部临检中心)。氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星(AK)、复方新诺明、氨曲南、头孢唑林(CFZ)、头孢吡肟(FEP)、头孢西丁、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)、环丙沙星(CIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦等药物以及BD细菌鉴定仪、药敏实验用培养基等均购自美国BD公司和英国Oxoid公司。药敏试验方法：用K-B纸片法和BD全自动细菌鉴定药敏系统及其配套的细菌鉴定卡，结果解读结合最新美国临床实验室标准化委员会(CLSI)的规定进行。

ESBLs确证试验：采用CLSI规则中的纸片扩散法进行ESBLs的表型验证。用无菌棉签蘸取麦氏比浊标准浓度为0.5的菌液，并在试管内壁轻轻旋转棉签挤去多余的菌液，涂布法接种于MH培养基，放置干燥10 min后，用无菌镊子夹取药敏纸片贴于琼脂表面，35℃培养箱培养16～18 h后判断结果。当头孢他啶/克拉维酸比单独头孢他啶抑菌圈直径增大≥5 mm或头孢噻肟/克拉维酸比单独头孢噻肟抑菌圈直径增大≥5 mm，则判定为细菌ESBLs阳性，反之为阴性。

改良霍奇试验(Modified Hodge Test，MHT)：对亚胺培南或美罗培南的MIC≥2 μg/ml的菌株进行MHT。用生理盐水制备麦氏比浊标准浓度为0.5的大肠埃希菌ATCC25922菌液，再用生理盐水或肉汤1∶10 稀释。用无菌棉签蘸取1∶10稀释后的菌液，并在试管内壁轻轻旋转挤去多余的菌液，涂布接种法接种于MH琼脂上，放置干燥10 min。用无菌镊子夹取厄他培南贴于培养基平皿的中央。用10 μl接种环挑取血琼脂平板过夜生长的3～5个待检菌落或质控菌株，从纸片边缘向外划直线，线的长度至少为20～25 mm。35℃培养箱培养16～20 h后记录结果。在大肠埃希菌ATCC25922的抑菌圈与待检菌或质控菌的交叉处有矢状出现则为MHT试验阳性。

1.2.2黏液丝实验 将KP受试菌株接种于5%羊血琼脂平板，于37℃孵育过夜，用细菌接种环轻柔向上挑起菌落，如不能挑起黏液丝或黏液丝长度<5 mm判断为阴性，如挑起的黏液丝长度≥5 mm判为阳性[5]。

1.2.3khe、rmpA及arobactin的检测 PCR检测方法如下：(1)制备DNA模板。挑取新鲜的KP菌落混悬于去离子水的离心管中，于沸水浴中或加热仪中100℃ 15 min，离心5 min(12000×g)，取上清液进行扩增。(2)PCR。用于扩增的引物序列和反应条件见参考文献[6]，基因扩增引物由上海生工所合成，反应总体积为25 μl，包含3种引物，将rmpA、khe、aerobactin三种引物一组扩增，dNTPS 0.5 μl(每种dNTP 终浓度为0.2 mmol/L)、引物各1 μl(终浓度0.6 μmol/L)、Taq酶0.5 μl、模板2 μl。

2 结果

2.1菌株鉴定 87株KP中黏液丝试验阳性菌株共20 株，rmpA携带株20株，aerobactin 携带株21株。22株KP通过黏液丝实验和毒力基因rmpA、aerobactin表型的鉴定符合hvKP的特征，其余65株为cKP。

2.2KP的耐药性 hvKP对抗菌药物的耐药率普遍低于cKP，对药物的敏感率高于cKP。65株cKP中碳青霉烯类耐药KP(CRKP)18株, ESBLs耐药表型40株；22株hvKP中CRKP 1株,hvKP中ESBLs耐药表型3株。药物敏感实验结果见表1、表2。

表1 hvKP及cKP的耐药情况[n(%)]

表2 KP的ESBLs和CRKP耐药情况[n(%)]

3 讨论

随着抗生素的普遍应用，细菌的耐药性成为全世界关注的问题之一。近年来，肠杆菌科细菌特别是KP对碳青霉烯酶药物的耐药率呈现出较快的上升趋势[7]，对头孢菌素类、喹诺酮类、丁胺卡那类以及β内酰胺类药物如哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦的耐药性增长显著。研究表明，质粒的可转移性是造成耐药基因快速传播的原因，对KP耐碳青霉烯类药物的增加起着重要的作用[5]。文献报道显示，与cKP相比，hvKP对抗生素的耐药性低，但是近几年来，hvKP的耐药性相对来说有所上升[8]，高毒力的hvKP如果同时具备高的耐药性，将会和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)一样，成为“超级细菌”中的一种，对临床病人感染的治疗将带来极大的挑战，所以 hvKP的耐药问题需要进一步研究。

本研究标本来源显示，易产生耐药菌株患者多为长期住院、有抗生素使用史者。通过rmpA、aerobactin鉴定、黏液丝实验结合病人临床症状对hvKP的实验室诊断进一步确定。药敏试验显示本研究中的hvKP对抗菌药物的耐药率都普遍低于cKP，与cKP相比，hvKP的CRKP、ESBLs耐药表型低，与多数报道一致[5]。

综上所述，KP引起的感染在临床上应该引起高度重视，特别是hvKP,一旦检出多重耐药菌株应及时进行药物敏感实验，以便于临床医师进行针对性的合理用药。医务工作者还需要加强对医院感染管理的认识，树立合理使用抗菌药物的理念，做好已有耐药性细菌的预防与治理管理，减缓KP耐药性的产生及播散。