丹参酮ⅡA联合右美托咪定通过AMPK/ULK1自噬通路减少肾缺血再灌注损伤作用的研究Δ

汤 霆，顾 晖，张柏银，唐吉伟

(湖南省脑科医院麻醉手术科，湖南 长沙 410011)

肾缺血再灌注损伤可以导致原发性移植肾功能障碍，并且是肾移植早期失败的主要原因[1]。因此，进一步深入研究肾缺血再灌注损伤的机制，对于临床上肾移植损伤的防治和相关理论研究有着重要意义。研究结果发现，细胞自噬在改善肾缺血再灌注损伤的病理过程中极为重要[2]。传统中药丹参具有活血化瘀的功效，其主要有效成分为丹参酮ⅡA，丹参酮ⅡA被广泛应用于临床，对肾缺血再灌注损伤有一定的保护作用[3]。右美托咪定为肾移植过程中常用的镇静镇痛药，研究结果显示，其在缺血再灌注损伤中具有一定的器官保护作用[4-6]。但丹参酮ⅡA联合右美托咪定的抗肾缺血再灌注效应是否增强尚不清楚。本研究旨在探讨丹参酮联合右美托咪定通过单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)通路介导的自噬减轻肾缺血再灌注损伤的作用，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

DT2000型计算机图像采集分析系统(日本尼康公司);MS-TS型电子天平(中国上海第二天平仪器厂);3 cm无创动脉夹(上海医疗器械有限公司);H500型电子显微镜(日本日立公司);SD1型全自动生化测定仪(瑞士罗氏公司)。

1.2 药品与试剂

丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(上海上药第一生化药业有限公司，规格为每支2 ml∶10 mg，批准文号为国药准字H31022558)；盐酸右美托咪定注射液[江苏恒瑞医药股份有限公司，规格为每支2 ml∶200 μg(按右美托咪定计)，批号为191011BP，批准文号为国药准字H20090248]；2%戊巴比妥钠(0.015 ml/kg，湖南中医药大学实验室配制)；抗β-actin兔多克隆抗体[圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司]；白细胞介素(IL)10酶联免疫吸附试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司)；AMPK一抗[圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司]；ULK1一抗[圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司]；肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司)；IL-6酶联免疫吸附试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司)。

2 方法

2.1 动物模型及分组

SPF级健康Wistar大鼠50只，体重200～250 g(湖南中医药大学动物中心提供)，随机均分为五组：A组(丹参酮ⅡA+右美托咪定)、B组(右美托咪定)、C组(丹参酮ⅡA)、D组(缺血再灌注模型)和E组(假手术组)。五组大鼠称重后，采用苯巴比妥钠65 mg/kg腹腔注射麻醉后制备大鼠急性肾缺血再灌注损伤模型。A、B、C和D组大鼠用无损伤血管夹阻断双侧肾蒂45 min，如果肾脏颜色先由鲜红色变苍白，再转为暗红色，则表明肾血管夹闭成功，同时用超声探头监测肾动脉血流情况。A、B和C组大鼠分别在缺血前30 min经腹腔注射丹参酮ⅡA注射液+右美托咪定25 μg/kg、右美托咪定25 μg/kg和丹参酮ⅡA注射液。D、E组大鼠给予等量0.9%氯化钠溶液。再灌注24 h后，取五组大鼠的肾组织和血标本。本研究方案已得到湖南省脑科医院伦理委员会批准。

2.2 观察指标

2.2.1 病理切片观察：经过脱水，石蜡包埋处理后，将肾组织切片3～4 μm，苏木精-伊红染色，光学显微镜下400倍观察，得出病理学结果。

2.2.2 细胞凋亡检测：细胞凋亡用TUNEL法检测。将3 μm厚度的肾组织石蜡切片进行脱蜡后，分别用核苷酸、TDT酶混合液、辣根过氧化物酶和蛋白酶K标二抗孵育，DAB显色。阴性对照组是没有TDT酶的基液。细胞核呈棕黄色颗粒或棕褐色为TUNEL阳性反应。随机抽取每张切片的5个高倍视野(400倍)，统计凋亡细胞数和细胞总数，根据公式计算凋亡指数(AI)，AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

2.2.3 AMPK和ULK1蛋白表达的检测：取肾组织标本0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，加入组织裂解液，离心20 min(6 000 r/min，离心半径10 cm)，设定4 ℃、10 000 g，用上清液进行蛋白定量检测；接着进行SDS-PAGE蛋白电泳，将其转移至硝酸纤维素膜中；最后使用含5%脱脂乳的TBST溶液在室温(25 ℃)密封保存1 h，分别加入抗ULK1一抗和抗AMPK过夜，维持4 ℃，TBST洗膜3次各5 min，加入上述二抗室温孵育1 h，将抗β-actin兔多克隆抗体作为对照，在Smart Chemi ECL下显影并分析灰度值(ImageJ2X软件)，以目的蛋白条带与对照(β-actin)蛋白条带的灰度值比值来反映ULK1和AMPK蛋白的表达水平。

2.2.4 细胞因子水平测定：将血标本2 ml于室温下静置30 min，离心5 min(6 000 r/min，离心半径10 cm)，留血清。参照说明书，采用酶联免疫吸附法测定血清TNF-α、IL-6和IL-10水平。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 肾组织病理学改变

A组大鼠肾小管扩张程度和肾小管上皮细胞肿胀程度均不明显，肾小球改变不明显；B组大鼠肾小球扩张程度轻，肾小管上皮细胞肿胀程度轻，肾小管扩张程度为中度；C组大鼠肾组织病理学改变与A组类似；D组大鼠肾组织则有明显病理变化，可见肾组织切片标本部分有凝固性坏死、脱落，光学显微镜下可见肾小球部分坏死，肾小管上皮细胞高度肿胀、变性，肾小管明显扩张，管壁增厚，管腔狭窄；E组大鼠肾组织在光学显微镜下可见肾小管排列整齐，间质无充血水肿，见图1。

A.A组；B.B组；C.C组；D.D组；E.E组A.group A;B.group B;C.group C;D.group D;E.group E图1 五组大鼠肾组织苏木精-伊红染色结果Fig 1 HE staining of renal tissue of rats in five groups

3.2 细胞凋亡情况

A、B、C、D和E组大鼠细胞的AI分别为(16.87±3.82)、(18.34±4.28)、(18.61±3.62)、(34.75±6.03)和(2.78±0.51)。E组大鼠细胞凋亡不明显；D组大鼠可见大量的凋亡细胞和严重的组织损伤；A组大鼠的组织损伤较轻，仅见散在的凋亡细胞；B、C组大鼠组织损伤轻微，可见少量的凋亡细胞。与E组比较，A、B、C和D组大鼠细胞的AI明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与D组比较，A、B和C组大鼠细胞的AI明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。TUNEL法检测的五组大鼠细胞凋亡情况见图2。

A.A组；B.B组；C.C组；D.D组；E.E组A.group A;B.group B;C.group C;D.group D;E.group E图2 TUNEL法检测的五组大鼠细胞凋亡情况Fig 2 Cell apoptosis detected by TUNEL method in five groups

3.3 AMPK和ULK1蛋白表达

与D组比较，A组大鼠肾组织中的AMPK及ULK1表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，且A组大鼠肾组织中的AMPK和ULK1表达较B、C组少(P<0.05)；与E组比较，A组大鼠肾组织中的AMPK和ULK1表达较多，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹法检测的五组大鼠肾组织中AMPK、ULK1蛋白表达情况见表1、图3。

图3 免疫印迹法检测的五组大鼠AMPK、ULK1蛋白表达情况Fig 3 AMPK and ULK1 protein expression detected by Western blot in five groups

表1 五组大鼠肾组织中AMPK、ULK1蛋白表达比较Tab 1 Comparison of AMPK and ULK1 protein expression in renal tissues of five groups of

3.4 组织因子水平

与E组比较，A、B、C和D组大鼠的炎症指标(IL-10、IL-6和TNF-α)水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与B、C和D组比较，A组大鼠的IL-6、TNF-α水平明显降低，IL-10水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 五组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平比较Tab 2 Comparison of serum levels of TNF-α,IL-6 and IL-10 among five groups of

4 讨论

传统中药丹参通过独特的辨证治疗和多靶点机制发挥护肾、改善气滞血瘀的功效。现代对丹参有较多的药理学研究。丹参酮是丹参的主要成分，丹参酮ⅡA注射液被广泛应用于临床，并且不良反应少。有研究结果认为，术前积极应用丹参酮ⅡA注射液可提高血清超氧化物歧化酶和血清谷胱甘肽过氧化物酶活性，有效改善术后肾缺血再灌注损伤，其机制是减少了缺血再灌注过程中产生的氧自由基从而减轻组织细胞的损伤[7]。缺血再灌注损伤属于西医的概念，在中医的范畴中并没有提及，但从中医学角度来看，人的精神活动由五脏精气化生和充养，存储精气，若精气不足，则肾虚，缺血即所谓气血亏虚，肾精亏损。缺血再灌注后，因肾精气不足，气血的运行受阻，血瘀气滞。丹参具有活血化瘀之功效。五脏藏精气而不泄，以藏为贵。气血运行通畅，则气血满盈，肾精得藏而复其功用。众多研究结果表明，丹参在脑、心肌及肾缺血再灌注损伤等方面均有较好的疗效[8-13]。可见丹参在活血化瘀通络方面发挥着重要作用，使脏得藏，腑得通，各得其用。

自噬是一种维持细胞内稳态和细胞完整性的“自我进食”过程。以微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅰ/Ⅱ和Beclin1的变化为特征的自噬功能障碍参与了各种肾损伤[14]。通常通过测定自噬标志性指标来检测所有活细胞中自噬的动态过程，除了上述2个指标外，还包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1、AMPK和ULK1复合物[15]。据文献报道，活化的AMPK可磷酸化ULK1，ULK1作为调节自噬的关键分子，可提高FUNDC1与LC3结合的效率[16]。提示AMPK可能通过上游启始蛋白ULK1的调节作用从而发挥细胞自噬功能。自噬与细胞凋亡有着密切关系。在某些情况下，上调自噬能抑制细胞调亡[17]；而抑制自噬则能导致细胞调亡[18]。相关研究结果揭示了自噬与炎症因子的关系，细胞因子的转录、调控和分泌在某种程度上受自噬的直接影响[19]。以上研究结果表明，自噬作用可能减轻炎症因子的释放，从而减轻肾缺血再灌注损伤。

本研究结果发现，肾缺血再灌注导致自噬关键分子AMPK和ULK1表达升高，IL-6、TNF-α表达增强，IL-10表达轻度升高；丹参酮ⅡA联合右美托咪定降低了AMPK和ULK1的表达及其磷酸化，抑制了炎症因子IL-6、TNF-α的表达，同时大幅增加了抗炎因子IL-10的表达。由此推断，肾缺血再灌注时，使用丹参酮ⅡA联合右美托咪定对肾功能有保护作用，可能是通过调控AMPK/ULK1信号通路，进而调控炎症相关因子(TNF-α、IL-6和IL-10)的表达水平，减轻组织一系列连锁炎症反应，抑制细胞凋亡，从而减少肾组织病理学改变，最终缓解肾功能损害。