高效液相色谱法测定中药制剂葛根汤颗粒中葛根素含量的研究

游贵君 姜建伟 陈 碧

1.福建省三明市食品药品审评与不良反应监测中心，福建三明365000；2.福建省三明市检验检测中心，福建三明365000

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，多年生落叶，藤本葛根汤是经典中药古方制剂，出自《伤寒论·辨太阳病脉证并治》[1]，被收录于药典，由葛根、麻黄、桂枝、白芍、甘草、生姜、红枣共7味药组成[2]，其中葛根为君药，利用葛根汤的传统配方制备成的葛根汤颗粒[3]，功能为发汗解表、升津舒经[4]，临床上主要用于发热鼻塞、恶寒、流涕、咳嗽咳痰、痰淡白稀薄、咽痒、出汗、头痛、全身酸痛、项背强急、口渴、泄泻等症[5]。葛根素为葛根中主要的化学和功效成分之一，其化学名称为4，7-二羟基-8-β-D葡萄糖基异黄酮，相对分子质量是416，性状为白色针状结晶[6-7]，有丰富而广泛的药理活性，也是葛根汤颗粒质量控制的一项重要指标。近年来，测定葛根素含量的方法主要有分光光度法及高效液相色谱法[8]，分光光度法（spectrophotometry，UV）的特点是当化合物组分简单时可作为一种比较常用简单快速测定葛根素的方法，但当样品成分构成较多且复杂时，若没有精准去除干扰将葛根素分离出来，测定结果常常受其他组分的影响。高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC），通过选择适宜的流动相使样品中各组分达到有效分离，经紫外检测器读取峰面积，使用外标法进行含量计算，HPLC具有高压、高效、高速、高灵敏度、高选择性等特点，本研究使用该方法进行葛根汤颗粒中葛根素的含量测定，方法具有操作简单，特异性高，快速检测等优点，并进行方法学考察研究，进一步验证该方法的准确性、有效性、重现性，是对葛根汤颗粒进行质量控制的有效可靠的方法[9-10]。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

实验材料：葛根汤颗粒（样品）由瑞阳制药 有 限 公 司 提 供（批 号：19051321、20020121、20022021）；葛根素标准品，购自中国食品药品检定研究院（批号：110752-201816），纯度≥ 95%；0.45µm滤膜购自山东西美生物技术有限公司；甲醇、无水乙醇、36%乙酸（国药集团化学试剂有限公 司，批 号：20190628、20190506、20190617）、纯化水。

实验仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪（四元泵、配置DAD检测器），电子天平（Secura225D-1CN）厂家为赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，超声波清洗器（KQ3200DE）厂家为昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

本研究考察的指标：线性实验、重复性实验、稳定性实验、耐用性实验、回收率实验等方法学考察及三批葛根汤颗粒样品含量测定。

1.2.1 标准溶液的制备 精密称取葛根素标准品，以30%乙醇溶解，定容至10 ml，混匀，制成每毫升含有2 mg葛根素的储备液。分别吸取葛根素标准液，配制成 5、10、20、30、40、50 µg/ml的系列标准液，以供液相色谱分析。

1.2.2 样品溶液的制备 将样品（葛根汤颗粒）研磨至细粉并混匀，称取细粉约0.5 g，精密称定。将称取后样品小心倒入具塞锥形瓶中，精密加入25 ml 30%乙醇，用盖密塞，称重并记录，将带样品的锥形瓶放入超声中进行超声处理30 min，取出后放置至室温，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，振荡摇匀后离心5 min（4000 r/min）。精密量取上清液5 ml，放置于100 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，振荡摇匀，供液相分析。

1.2.3 测定 将标准品溶液、样品溶液和阴性溶液分别过0.45 µm滤膜后待液相色谱分析。

1.2.4 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SBAq C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：甲醇-36%乙酸-水（25∶3∶72）；流速：0.6 ml/min；波长：247 nm；柱温：30℃ ；进样量：10 µl。

1.2.5 计算 葛根汤颗粒中葛根素含量计算公式如下：

式中：X-试样中葛根素的含量（mg/g）；A1-试样中葛根素的峰面积；A2-标准液中葛根素的峰面积；C-标准液的质量浓度浓度（µg/ml）；V1-试样初始定容体积（ml）；V2-上清液体积（ml）；V3-进样前试样定容体积（ml）；m-试样质量（g）。

1.2.6 线性关系考察 取标准液进行液相色谱分析。线性的标准曲线以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行绘制，得线性标准曲线方程为：y=0.4019x+0.3518，R2=0.9997，证明葛根素在5.31～50.59 µg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。见图1。

图1 葛根素线性关系图

1.2.7 重复性实验 取样品，按1.2.2项下方法制备6份样品溶液，并按1.2.4项下所列的色谱条件进行测定分析。

1.2.8 回收率实验 称取9份样品（含量为6.92 mg/100 g），每份约 0.25 g，精密称定，按顺序编号并分为3组：1～3、4～6、7～9，按组分别精密加入3 种浓度对照品溶液 1 ml（1.40、1.70、2.08 mg/ml），按1.2.2项下所列方法进行含量测定，并计算回收率。结果见表3。

1.2.9 三批样品含量测定 取三批葛根汤颗粒样品，依据《中华人民共和国药典（一部）》[2]按1.2.2项下方法进行样品制备，按照1.2.4项下色谱条件进行测定分析。结果见表4。

2 结果

2.1 样品重复性实验结果

实验结果表明：应用本方法测定葛根素含量，重复性较好。见表1。

表1 样品重复性实验结果

2.2 耐用性实验

分别考察样品中葛根素含量在不同流速（0.6、0.8、1.0 ml/min）、不同柱温（25、30、35℃）及不同色谱柱条件下的含量变化。结果显示RSD分别为0.95%、0.63%、1.21%，表明应用本方法测定葛根素含量，方法耐用性较好。

2.3 稳定性实验

实验结果表明，应用本方法测定葛根素的含量，该方法中样品溶液峰面积在24 h内变化不大，证明稳定性良好。见表2。

表2 样品溶液的稳定性实验结果

2.4 回收率实验

实验结果表明：样品的平均回收率为97.16%，RSD=0.90%，此方法准确可行。见表3。

表3 回收率实验测定结果

2.5 三批样品含量测定

实验结果表明，三批样品含量测定平均值是（6.90±0.01）mg/g，高于现行最低含量要求，批内与批间差异均不大。见表4。

表4 三批样品葛根素含量测定结果

3 讨论

葛根为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，葛根汤为中医的传统经典古方[11]，以葛根为君药，佐以麻黄、桂枝、白芍、甘草、生姜、红枣等中药配伍，按照现代制剂工艺制成葛根汤颗粒，从古至今，葛根汤被广泛应用，主治外感风寒、无汗畏风等症状[12]。现代实验研究证明葛根汤对抗炎、镇痛、活血及抑菌等方面有较好的作用[13]。葛根素为葛根中主要化学成分之一，也是葛根汤颗粒中主要功效成分[14]，因此，测定葛根汤颗粒中葛根素的含量，对其质量标准的建立具有积极的意义。

本研究应用高效液相色谱法对葛根汤颗粒中葛根素进行方法学研究及含量测定，实验结果为：葛根素在5.31～50.59 µg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y=0.4019x+0.3518，R2=0.9997；重复性实验平均值为6.92 mg/g，RSD为0.97%，证明该方法重复性较好；稳定性实验考察24 h样品含量变化，RSD为0.68%，表明稳定性良好；耐用性实验分别进行不同流速、不同柱温、不同色谱柱条件下葛根素含量的考察，RSD分别为0.95%、0.63%、1.21%，耐用性良好。回收率实验分别考察低、中、高三组不同对照品加入量，回收率的平均值为97.16%，RSD为0.90%，表明回收率良好。考察三批样品，每批5个平行试样，结果表明三批样品含量测定平均值是（6.90±0.01）mg/g，批内与批间差异均不大。

本研究在实验过程中应注意控制样品处理的时间、温度等可能影响实验结果的细节操作，葛根素具有广阔的市场前景，可创造一定的经济价值，综上所述，应用HPLC进行葛根汤颗粒中葛根素的含量测定，该方法准确性高，可靠性好，适用于葛根汤颗粒质量标准的建立。

随着现代医学的不断发展，临床上越来越多的开展了中医经典方剂的应用，葛根汤作为其中较为典型的一个经方，其组方配伍适宜，用量得当[15]，被现代医学应用于较多系统疾病的治疗中，因此其质量标准的建立尤为重要，把好质量关，为葛根汤广泛应用于临床治疗提供依据。