脆弱拟杆菌PSA对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用

甘伙烨 彭铁立 覃喜香 杨荣娇 周小俐

广东省清远市人民医院 广州医科大学附属第六医院 广州医科大学消化病研究所，广东清远 511500

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种结直肠慢性非特异性疾病，临床主要表现为腹痛、腹泻和黏液血便，多呈反复发作。在国内外，该病的发病率和患病率都呈上升趋势，而在我国则更加明显[1-5]。UC的病因和发病机制尚未明确，但目前认为肠道菌群失调是其发病的一个重要触发点。临床研究表明脆弱拟杆菌（bacteroides fragilis，B.fragilis）有改善肠道炎症的作用，它表面多糖中的多糖A（PSA）是起益生作用的主要成分。目前对PSA在治疗UC中的作用及相关机制还知之甚少。本实验将采用葡聚糖硫酸钠诱导的慢性UC小鼠模型，初步探讨B. fragilis PSA对UC的治疗效果及可能机制，以期为临床应用B. fragilis尤其是其PSA成分治疗UC提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级雄性BALB/c小鼠24只，鼠龄6～8周龄，体重21～26 g，平均（23.2±1.0）g，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号为SYXK（粤）2019-0206。

1.2 仪器与试剂

葡聚糖硫酸酯钠盐（DSS）购自美国MP Biomedicals公司，批号为0216011080；粪便隐血检测试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司；ELISA试剂盒购自北京鸿跃创新科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组和干预方法 小鼠适应性喂养7 d，采用随机数字表法分为正常对照组、DSS组、DSS+PSA组，每组各8只。各组干预情况如下：正常对照组，该组小鼠常规饲养，不进行任何处理。DSS组，参考Wirtz等[6]的造模方法，第一周期给予2%DSS溶液小鼠自由饮用7 d，然后给予小鼠自由饮用蒸馏水14 d；重复一周期后，再给予小鼠自由饮用2% DSS溶液7 d。DSS+PSA组，在给予DSS组处理基础上，每天给予浓度为100 µg/ml的PSA液0.5 ml灌胃，最后在第51天予二氧化碳处死小鼠。

1.3.2 疾病活动度 从造模之日起，每天监测小鼠体重，观察小鼠活动、精神、饮食、大便性状和便血情况，并计算小鼠的疾病活动指数（disease activity index，DAI）以判断造模情况及观察疗效。DAI为体重下降、大便性状及便血情况评分的总和，评分标准如下[7]：体重下降≤1%、1%＜体重下降≤5%、5%＜体重下降≤10%、10%＜体重下降≤20%和体重下降＞20%分别计为0、1、2、3和4分；无便血、大便隐血（+）和肉眼血便分别计为0、2和4分；大便性状正常、松散（呈糊状或半成形大便，不黏附于肛门）和稀便（呈稀水样便）分别计为0、2和4分；每只小鼠的DAI评分为3项的平均值。

1.3.3 结肠大体形态及组织病理学 观察结肠大体形态，将小鼠结肠组织以10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋并制备4 µm切片，行HE染色，以盲法观察，光镜下观察肠黏膜损伤情况，采用Shah等[8]标准对结肠组织的HE染色切片进行结肠黏膜损伤指数（colon mucosal damage index，CMDI）评估。

1.3.4 ELISA检测 小鼠摘除眼球采血，4℃低温高速离心机中2500 r/min离心20 min，收集上清液，用ELISA法测定血清核因子（NF）-κB水平，操作流程按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0统计学软件，符合正态分布的计量资料以（）表示；两组间均数的比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠DAI、CMDI评分比较

正常对照组小鼠大便正常、体重增加、毛发有光泽、饮食、活动均正常。DSS组小鼠从第6天开始出现毛发无光泽、活动减少、稀便，大便带血或血便等，造模成功。DSS+PSA组小鼠从第23天开始出现毛发无光泽、活动减少、稀便，大便带血或血便等，各组无小鼠死亡。与正常对照组比较，DSS组、DSS+PSA组小鼠DAI评分均明显增高，差异有统计学意义（F=12.8602，P=0.0002）；DSS+PSA 组小鼠DAI评分较DSS组明显降低，差异有统计学意义（t=5.7277，P=0.0312）。与正常对照组比较，DSS组、DSS+PSA组小鼠CMDI评分均明显增高，差异有统计学意义（F=28.8126，P=0.0000）；DSS+PSA 组小鼠CMDI评分较DSS组明显降低，差异有统计学意义（t=8.1911，P=0.0081）。见表 1。

表1 各组小鼠DAI、CMDI评分比较（，分）

表1 各组小鼠DAI、CMDI评分比较（，分）

组别 n DAI评分（51 d） CMDI评分正常对照组 8 0.00±0.00 2.08±0.83 DSS组 8 2.50±0.75 17.65±3.02 DSS+PSA组 8 1.75±0.46 8.07±1.35 F值 12.8602 28.8126 P值 0.0002 0.0000

2.2 小鼠结肠大体形态

正常对照组小鼠结肠长度正常，无充血水肿和溃疡形成；DSS+PSA组小鼠结肠长度稍缩短，局部充血，沿肠系膜剪开可见糜烂形成；DSS组小鼠结肠缩短、肠壁僵硬、充血，沿肠系膜剪开可见糜烂甚至溃疡，程度较DSS+PSA组更严重，见图1。

图1 三组小鼠结肠大体形态

2.3 小鼠结肠组织HE染色情况

HE染色结果显示DSS+PSA组小鼠结肠黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落，杯状细胞减少，部分腺体结构紊乱、排列不规则伴炎症细胞浸润；DSS组小鼠结肠黏膜上皮破坏更严重，可见隐窝结构消失、溃疡形成，大量炎症细胞浸润黏膜和黏膜下层，见图2。

图2 各组小鼠结肠组织HE染色 （×200）

2.4 ELISA检测各组小鼠血清NF-κB浓度

正常对照组、DSS组、DSS+PSA组小鼠血清NF-κB浓度分别为（76.5±9.6）ng/L、（142.0±17.6）ng/L、（107.0±15.6）ng/L。与正常对照组相比，DSS组、DSS+PSA组小鼠血清NF-κB浓度均明显升高，差异有统计学意义（F=32.343，P=0.0000）；DSS+PSA组小鼠血清NF-κB浓度较DSS组明显下降，差异有统计学意义（t=6.182，P=0.0012）。

3 讨论

UC是发生在结直肠黏膜及黏膜下层的慢性非特异炎性疾病，以肠道炎症及黏膜损伤为主要病理表现[9-11]，目前认为其发病机制可能与肠道菌群失调、易感基因、环境因素及免疫系统异常的相互作用有关[12-14]。

正常情况下肠道菌群构成一个相互制约、相互依存的微生态平衡系统，对人体的健康起到重要作用，一旦这种平衡被打破，则会引起肠道菌群失调，从而引发疾病或者加重病情。

人类肠道内有超过1000种，约10万亿个细菌，占总数约1/4的拟杆菌是其中的优势菌群，B. fragilis作为拟杆菌的代表菌株，寄居于人结肠黏膜，B. fragilis则为一种条件致病菌。有研究报道称，B. fragilis的表面多糖是发挥益生特性的主要成分，B. fragilis可通过多种方式发挥其益生特性，它可通过淀粉利用系统去分解食物多糖和机体黏蛋白多糖，占据不同的代谢位而定植于肠道[15]，还可以利用自身的共生菌定植因子影响其他菌群的定植，维持肠道菌群的平衡，而在给予自闭症模型B. fragilis处理后发现其肠道内的未分类拟杆菌和毛螺旋菌科的丰度显著增多[16]。

NF-κB是一种转录因子，广泛存在于各种组织中，NF-κB在核内与κB序列结合促进各种炎性细胞因子如TNF-α、IL-2、IL-10、IL-1β等基因转录，在免疫和炎症反应及一些疾病急性期反应方面起重要作用，参与细胞凋亡等多种生理病理过程相关基因的转录调控。在UC中，NF-κB被诱导激活，调节炎症递质的产量，进而导致UC炎症黏膜损伤[17-18]。

本研究显示，利用2% DSS诱导的慢性溃疡性结肠炎小鼠模型，小鼠自由饮用2% DSS一段时间后会出现毛发无光泽、活动减少、稀便，大便带血或血便等现象，小鼠结肠出现明显短缩，肠壁僵硬、充血，可形成糜烂甚至溃疡，显微镜下可见其结肠黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落，杯状细胞减少，部分腺体结构紊乱，隐窝结构消失，大量炎症细胞浸润黏膜和黏膜下层，给予小鼠B. fragilis PSA可使其推迟出现毛发无光泽、活动减少、稀便，大便带血或血便等现象，且前述结肠损伤可获得明显缓解。小鼠自由饮用2% DSS一段时间后血清NF-κB浓度可明显升高，而给予小鼠B. fragilis PSA可明显减轻其血清NF-κB浓度的升高。因此，B. fragilis PSA能明显改善UC小鼠的精神状态、DAI评分、CMDI评分、结肠大体形态及组织病理学损伤，抑制NF-κB的表达，从而发挥治疗UC 的作用。