免疫球蛋白G4荧光免疫层析定量检测试剂的研制及性能评价

杨晓妍 张乐之 贺琤雯

1海军军医大学第一附属医院体检中心，上海 200433；2海军军医大学第一附属医院实验诊断科，上海 200433

IgG4相关性疾病(immunoglobulin G4-related disease，IgG4-RD)是一种原因不明的慢性自身免疫介导的炎症性、纤维化性疾病，可累及全身多个器官和系统。2001年Hamano等[1]首次报道硬化性胰腺炎患者血清IgG4浓度升高。孙林等[2]报道血清IgG4对自身免疫性胰腺炎(autoimmune pancreatitis，AIP)与慢性胰腺炎、胰腺癌的鉴别诊断具有重要价值。近年来IgG4作为AIP早期诊断、疗效检测和预测复发的指标，在AIP诊治方面起到了重要的作用[3]。目前定量检测IgG4的方法主要有酶联免疫吸附法[4]、免疫散射比浊法[5]。酶联免疫吸附法灵敏、特异，但需多次洗涤和孵育，操作繁琐，且定量测定结果不稳定。免疫散射比浊法具有精确、简便、可重复性强等优点，但脂血或溶血样本会干扰IgG亚类的检测，且成本较高。本研究建立了一种适用于即时检验(point of care testing，POCT)的荧光标记技术与免疫层析技术相结合的快速定量检测方法，适用于门急诊批量样本的定量检测。

材料与方法

一、材料

收集海军军医大学第一附属医院检验科经全自动蛋白分析仪BNⅡ系统测定过IgG4浓度的383例临床血清样本，其中胰腺炎相关疾病115例，其他疾病268例。杭州康知生物科技有限公司提供的200例健康人(年龄均>18岁，男女比例各50%)血清样本IgG浓度作为正常参考值。

鼠抗IgG4单克隆抗体、IgG4参考品及荧光微球由杭州康知生物科技有限公司提供。干式荧光免疫分析仪由苏州和迈精密仪器有限公司生产。硝酸纤维素膜(NC膜)购自德国Sartorius Stedim公司。全自动蛋白分析仪BNⅡ系统和IgG4测定试剂盒(免疫散射比浊法)购自西门子医学诊断产品(上海)有限公司。

二、方法

1．荧光免疫层析法检测IgG4的原理：将免疫层析法与荧光定量技术相结合，采用竞争法反应模式，以鼠抗人IgG4单克隆抗体标记在时间分辨荧光微球上作为检测抗体，NC膜的检测线(T线)包被大肠杆菌表达的IgG4抗原，质控线(C线)包被羊抗鼠IgG，将样本与荧光微球均匀混合，通过层析方法检测。若样本中含有IgG4，首先与荧光微球上标记的IgG4抗体相结合，再与C线上的羊抗鼠IgG形成免疫复合物；若样本中不含IgG4，则荧光微球上标记的IgG4抗体与T线上的IgG4抗原形成免疫复合物。T线和C线上的荧光信号比值(T/C值)与待测样本的IgG4含量呈反比。根据IgG4标准曲线计算待测样本的IgG4含量。

2．荧光免疫层析试剂盒的制备：(1)检测卡制备。用包被缓冲液分别将IgG4抗原和羊抗鼠IgG抗体稀释至0.2 mg/ml，喷涂到NC膜上相对应的T线和C线，45℃过夜烘干。底板上依次粘贴样品垫、NC膜和吸水纸，组装成检测卡(图1)，4～30℃保存备用。(2)鼠抗人IgG4单抗标记的荧光微球制备。将荧光微球溶解于硼酸缓冲液，加入适量碳化二亚胺(1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺，EDC)，室温活化15 min，加鼠抗人IgG4单抗，室温震荡标记2 h，然后加入封闭液封闭1 h后离心，按(100～200)∶1比例用硼酸缓冲液重悬鼠抗人IgG4单抗标记的荧光微球，置2～8℃保存备用。(3)IgG4标准曲线ID卡。测试9.87、5.20、2.72、1.20、0 g/L IgG4标准品的荧光信号均值，输入干式荧光免疫分析仪软件，四参数logistic拟合标准曲线，制备ID卡。

图1 检测卡组成

3．荧光免疫层析法的性能评价：(1)线性范围。参考《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》，取高浓度样本(接近10 g/L)、低浓度样本(样本稀释液)各一份，依次按照10/10、8/10、4/10、2/10、1/10、1/20、1/50稀释，重复测定3次，计算每点均值作为Y轴，以理论浓度值为X轴，做散点图并进行直线回归分析。(2)精密度与准确度。分别对浓度为1.20 g/L和2.65 g/L的IgG4标准品进行检测，每个浓度测试10次，取均值，计算各浓度变异系数(coefficient of variation, CV)和准确度偏差。(3)干扰试验。选择临界值附近的血清样本，分别配制含0、0.5、1.25、2.5、3、5 g/L的胆红素样本，含0、2、5、10、30、35 g/L的三酰甘油样本，含0、2、5、10、12、15 g/L的血红蛋白样本，每个浓度样本测试3次，取均值，计算均值与0浓度组的偏差，偏差在±15%范围内为本产品可接受的干扰物浓度。(4)稳定性试验。将成品置于2～8℃冷库保存，分别于第1、3、6、9、11、12、13、14个月测试浓度为1.20 g/L和2.65 g/L的IgG4标准品，每个浓度测试3次，取均值，计算均值与理论浓度的偏差，偏差在±15%以内为试剂稳定性良好。(5)正常参考值试验。应用荧光免疫层析试剂盒检测200例健康人血清样本的IgG4浓度，确定IgG值的正常参考范围。(6)临床应用验证。应用荧光免疫层析试剂盒检测383例临床血清样本的IgG4浓度，并与西门子IgG4测定试剂盒(免疫散射比浊法)检测值比较，评价两种方法的一致性。

三、统计学处理

结 果

一、荧光免疫层析法定量检测IgG4的线性范围和标准曲线

分析结果显示，理论值与实测值相关性良好，在样本浓度(0.2～10)g/L范围内，回归方程为Y=1.0841X-0.379，相关系数R2=0.9970，结果呈线性(图2)。荧光免疫层析法定量检测IgG4的荧光信号T/C值与IgG4参考品浓度呈平滑递减曲线(图3)，回归方程为Y=(0.96339+0.02874)/[1+(X/1.97249)0.99397]-0.02874，R2=0.99935，拟合度较高。

图2 不同浓度IgG4实测值与理论值回归图

图3 荧光免疫层析法测定IgG4的标准曲线

二、荧光免疫层析法定量检测IgG4的精密度与准确度

对浓度为1.20 g/L IgG4的标准进行检测，结果为(1.31±0.09)g/L，CV为7.2%，准确度偏差为8.8%；对浓度为2.65 g/L IgG4标准品进行检测，结果为(2.84±0.16)g/L，CV为5.6%，准确度偏差为7.2%。各检测浓度的CV均<15%，准确度偏差均在±15%以内，荧光免疫层析法精密度和准确度高，临床可接受。

三、荧光免疫层析法定量检测IgG4的抗干扰能力

不同浓度干扰样本与0浓度组检测偏差见表1，当样本中的血红蛋白、三酰甘油、胆红素的浓度分别为10、10、2.5 g/L时，测试结果偏差均在±15%以内，不会对结果产生明显干扰，说明荧光免疫层析法抗干扰能力强。

表1 荧光免疫层析法定量检测IgG4的抗干扰性

四、荧光免疫层析法定量检测IgG4的稳定性

14个月内检测浓度为1.20、2.65 g/L的IgG4标准品，各浓度偏差均在±15%以内(表2)，表明荧光免疫层析法定量检测IgG4较稳定，故试剂盒有效期定为12个月。

表2 荧光免疫层析法定量检测IgG4的稳定性

五、荧光免疫层析法定量检测IgG4的正常参考值

表3 200例健康人血清IgG4浓度频数分布

六、荧光免疫层析定量检测IgG4的临床应用验证

西门子BNⅡ系统IgG4测定试剂盒(散射比浊法)检测结果显示，383例血清样本中56例IgG4≤0.20 g/L，249例为0.20～2.03 g/L，74例为2.03～10 g/L，4例>10 g/L。荧光免疫层析定量检测试剂盒检测结果显示，383例血清样本中42例IgG4≤0.20 g/L，267例为0.20～2.03 g/L，71例为2.03～10 g/L，3例>10 g/L。两组数据有显著相关性(图4)，线性回归方差为Y=0.9924X-0.0240，R2=0.9880，P<0.05，方程斜率的95%CI为0.9814～1.0034，截距的95%CI为-0.0776～0.0297。经秩和检验，两种检测方法的结果偏差无统计学意义(Z=-0.7141，P=0.4752)，具有很好的一致性。

荧光免疫层析法定量检测的IgG4值的ROC曲线分析见图5，AUC值为0.992，95%CI为0.953～1.000，计算获得的临界值为2.01 g/L，诊断胰腺炎相关疾病的灵敏度为96.3%，特异度为95.5%。

图4 荧光免疫层析法与免疫散射比法检测IgG4结果的相关性

图5 荧光免疫层析法定量检测胰腺炎相关疾病IgG4的ROC曲线

讨 论

AIP是一种自身免疫介导的胰腺慢性炎症，是慢性胰腺炎的特殊类型，目前发病机制尚不清楚。作为全新的临床疾病独立分型，AIP正受到越来越多的关注，其早期诊断与治疗、预测复发与判断预后及提高诊治水平已成为目前研究的重点。目前AIP的诊断标准主要有日本胰腺协会(JPS)2006年修改后标准[6]、韩国2006年Kim标 准[7]、美国MayoClinic的2006年HISORt标准[8]和2008年的亚洲标准[9]，以及最近发表的IgG4相关性疾病诊治中国专家共识[10]。虽然AIP诊治标准不尽相同，但以上各标准中的血清学指标均包括血清 IgG4水平升高，可见血清 IgG4水平升高对 AIP的诊断非常重要。近年来IgG4作为AIP早期诊断、疗效检测和预测复发的指标，为AIP的诊治开辟了新的途径[11]。

本研究建立了一种快速检测血清IgG4的方法，检测的线性范围为0.2～10 g/L，试剂盒在线性范围内对200例健康人血清IgG4水平进行检测，通过95百分位法分析，得到健康人血清IgG4的95%CI的上限为2.03 g/L。临床验证结果证实，该试剂盒与西门子BNⅡ系统免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)具有良好的相关性(R2=0.9880)，两种检测方法结果偏差无统计学意义，具有一致性。通过ROC曲线分析，以2.01 g/L为临界值，该试剂盒诊断胰腺炎相关疾病的灵敏度为96.3%，特异度为95.5%。

目前，血清IgG4含量检测的方法主要有放射免疫扩散法、酶联免疫吸附法、散射比浊法。本研究采用荧光免疫层析法，是将抗体使用荧光标记物进行标记，通过免疫层析的方法使标记抗体和待测物在膜上通过毛细管作用进行层析。 该方法是一种微量分析方法，根据荧光强度，对物质进行定量分析，具有高灵敏度、选择性强、需要样本量少及操作简便等优点；还具有试剂以及仪器方便携带、试剂稳定性好、操作简单不需要专职人员操作、可以进行临床实时检测服务的特点。

与现有同类产品相比，本研究所建立的的IgG4荧光免疫层析定量检测方法为国内首创，具有良好的精密度和准确度，不受血清血红蛋白、三酰甘油和胆红素等干扰物质的影响，试剂盒12个月内有效；检测的灵敏度和特异度高达96.3%及95.5%，重复性和稳定性好，与散射比浊法具有良好的相关性(R2=0.9880)；仅需20 μl抗凝血浆样本，样本随到随检，仪器测试时间<5 s，整个检测流程短，15 min即可出报告；有3种适用的轻便机型，设备便携，可采用单机或PC联机工作模式，仪器接口多样，支持医院LIS系统连接功能，操作简便；试剂盒内配的ID卡可存储标准曲线，实现精准定量，因此适用于各大医院门急诊检验科和基层医院等应用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突