p16、微型染色体维持蛋白2、Ki-67在宫颈鳞状上皮内病变的表达与意义

蒋莉萍，吴凤珍，肖 艳，胡利娟，刘媛媛

（1.吉安市妇幼保健院病理科；2.吉安市妇幼保健院妇产科，江西 吉安 343006）

宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）是一组与宫颈浸润癌密切相关的癌前病变的统称，以CINⅠ为低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL），CIN Ⅱ级、CIN Ⅲ级为高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），因此早期诊断与治疗子宫颈鳞状上皮内病变（squamous intraepithelial lesion, SIL）是降低宫颈癌发病率与死亡率的关键。p16是多种肿瘤抑制基因，是一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂，其被视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）介导的G1/S期转化所调控，可在持续性高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染机体中过度表达并导致细胞周期失控；Ki-67是一种最常用的细胞核增殖标志物，可表达于除G0期之外的各细胞周期阶段；p16与Ki-67均可作为细胞周期调控失调的标志物，其水平与HR-HPV诱导的癌性转化相关，但因p16存在假阳性和阴性的情况，且Ki-67特异性有待提高，所以需联合其他分子标志物来提高SIL的诊断准确度[1-2]。微小染色体维持蛋白2（MCM2）是一种细胞增殖标志物，在真核细胞DNA复制的起始和延伸过程中发挥重要作用，同时其只表达处于增殖活动周期的细胞内，若阴性表达，则意味着细胞退出细胞的增殖周期，成为分化成熟的细胞或进入G0期，因此MCM2蛋白也可以作为细胞增殖的特殊标记物[3]。但目前关于MCM2在SIL组织中的表达情况研究较少，因此本研究旨在探讨p16、MCM2、Ki-67在SIL中的表达意义，并分析三者阳性表达的相关性，现将研究结果详细报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析吉安市妇幼保健院2017年7月至2019年10月收治的240例CIN患者的临床资料，年龄18～68岁，平均（40.66±9.15）岁；另回顾性分析同期收治的50例慢性宫颈炎患者的临床资料，年龄35～66岁，平均（45.74±9.29）岁；另回顾性分析同期收治的20例宫颈浸润性鳞癌患者的临床资料，年龄25～61岁，平均（44.64±8.43）岁。诊断标准：参照《WHO（2014）女性生殖器官肿瘤分类解读》[4]中关于CIN与宫颈癌的相关诊断标准。纳入标准：所有患者均对应符合上述诊断标准；均经宫颈活检、宫颈管诊刮检查，并经病理诊断确诊；均已婚；年龄18周岁以上；已婚或有过性生活史；CIN及宫颈浸润性鳞癌患者进行宫颈LEEP术切除治疗，慢性宫颈炎患者经保守治疗；临床资料完整。排除标准：接受相关放化疗治疗者；妊娠或哺乳期妇女；合并其他恶性肿瘤及其他器质性病变者等。3组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P> 0.05），组间具有可比性。本研究已经吉安市妇幼保健院医学伦理委员会批准实施。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 采用SP法免疫组织化学染色检测MCM2、p16、Ki-67在病理组织中的表达情况：病理标本经4%中性甲醛固定，常规制作石蜡组织切片，进行免疫组织化学染色，所涉一抗：兔抗人MCM2单克隆抗体（克隆号：EP40），鼠抗人p16单克隆抗体（克隆号：1C1），鼠抗人Ki-67单克隆抗体（克隆号：UMAB107），均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。将已知的阳性组织作阳性对照，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。

1.2.2 免疫组织化学染色结果判定方法 采用半定量评分法据每张切片阳性细胞百分数及染色程度进行计分。①p16阳性表达定位于细胞核和细胞浆，根据细胞核和或细胞浆染色强度进行计分：无表达为0分；淡黄色为1分；（+）黄色为2分；（++）棕黄色为3分；据阳性细胞百分比将结果分为<10%为（-），计0分；11%～25%为（+），计1分；26%～50%为（++），计2分；51%～75%为（+++），计3分；>76%为（++++），计4分。②MCM2和Ki-67阳性表达定位于细胞核，根据阳性细胞分布情况判定：阳性细胞在鳞状上皮分布的垂直平面，由下向上，基底层与基底旁细胞着色判为（-），计0分；将基底旁细胞以上至表层分为2份，下1/2细胞着色判为（+），计1分；超过下1/2细胞着色判为（++），计2分；染色强度评分方法同p16。p16、MCM2、Ki-67免疫组化染色评分=染色强度评分+阳性细胞百分比评分，分值范围0～7分，其中 < 2分为（-）；2～3分为（+），≥4分（++）。经3位病理高级医师判定，在判定结果中若同一病例存在不同评分视野，则取最大值和最小值的平均值；参考半定量标准，随机观察5个高倍视野，计算阳性细胞百分比及染色强度评分。结果均经2次重复观察，计分不一致者再次观察确认。

1.3 观察指标 ①观察典型病例p16、MCM2、Ki-67免疫组织化学染色结果；②统计并比较不同患者病理组织中p16、MCM2、Ki-67 阳性表达情况；③分析 p16、MCM2、Ki-67阳性表达的相关性。

1.4 统计学方法 将本研究所有数据均采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，计数资料以[例(%)]表示，组间比较采用χ2检验；双变量相关性分析采用Spearman等级相关性分析。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p16、MCM2、Ki-67阳性表达情况 p16在正常子宫颈鳞状上皮组织中呈阴性表达（-），见图1-A；在LSIL组织中呈阳性表达（+），上皮基底层及副基底层细胞连续弥漫阳性，见图1-B；在HSIL、鳞癌组织中呈阳性表达（++），全层弥漫阳性，见图1-C。MCM2、Ki-67在正常子宫颈鳞状上皮基底层组织中呈阴性表达（-），见图2-A、图3-A；MCM2、Ki-67在LSIL组织呈阳性表达（+），上皮下1/2区域阳性，见图2-B、图3-B；MCM2、Ki-67在HSIL和鳞癌组织中呈阳性表达（++），全层弥漫阳性，见图 2-C、图3-C。统计学分析显示，CIN Ⅰ级、CIN Ⅱ～Ⅲ级、浸润性鳞癌患者病理组织中p16、MCM2、Ki-67阳性表达率均显著高于慢性宫颈炎患者，且CINⅡ～Ⅲ级、浸润性鳞癌患者显著高于CINⅠ级患者，差异均有统计学意义（均P< 0.05），见表1、表2、表3。

表1 不同宫颈病变患者病理组织p16阳性表达情况比较

表2 不同宫颈病变患者病理组织MCM2阳性表达情况比较

表3 不同宫颈病变患者病理组织Ki-67阳性表达情况比较

2.2 p16、MCM2、Ki-67表达的相关性Spearman相关性分析显示，p16与MCM2阳性表达呈正相关（r= 0.691）；p16与Ki-67阳性表达呈正相关（r= 0.556）；MCM2与Ki-67阳性表达呈正相关（r= 0.676），差异均有统计学意义（均P<0.05），见表4。

表4 p16、MCM2、Ki-67表达的相关性

3 讨论

众所周知，宫颈癌癌前病变病理组织学诊断中CIN分级的不一致性问题一直存在，尤其对于一些年轻且诊断经验不足的病理诊断医师和非妇科病理医师来说，普遍存在CINⅡ级的低诊断率现象。CINⅡ级属于一种生物学上模棱两可的病变，在现实工作中其诊断的可重复性差。近年来，p16、Ki-67虽已在辅助宫颈癌前病变的病理诊断中广泛应用，但p16、Ki-67的表达与细胞病变程度常常不一致，并受外界因素干扰较大，且p16、Ki-67对低危型人乳头瘤病毒（LR-HPV）感染所致的宫颈病变易漏诊和误诊[5]。因此，寻找敏感度与特异度更高的分子标志物在临床诊断中意义重大。

在没有免疫组化辅助手段的诊断时代，病理诊断医师只能借助各自积累的经验来判断。LAST项目认为，当形态学不能诊断为CINⅠ级、CINⅢ级时，为了尽可能地降低误诊而不赞成过度使用p16，同时不提倡在LSIL诊断中采用p16的免疫组化，其认为，在苏木精-伊红（HE）染色为LSIL的前提下，p16免疫组化对于预后并无预测意义；不能因为p16阴性或斑片状阳性而将病变级别降为阴性，也不能因核浆弥漫着色、强阳性、点状着色p16表达阳性而将其病变升级为HSIL[6]。当患者为LR-HPV感染所致的CINⅠ级病变时，p16常常显示阴性或局灶斑片着色，而MCM2此时大多能标记副基底层以上的细胞（大于黏膜厚度的25%～30%），故说明MCM2恰好能弥补p16的缺陷和不足。因此，依靠MCM2获得诊断信息而增加CINⅠ级的诊断依据，并与Ki-67标记的增殖指数相结合，能更好地辅助HE切片病理诊断。对于微小不易发现或极易漏诊的病灶，MCM2也能和p16一样将病变处凸显出来，增加异常病变的检出率[7]。本研究结果显示，CINⅠ级、CINⅡ～Ⅲ级、浸润性鳞癌患者病理组织中MCM2、Ki-67阳性表达率均显著高于慢性宫颈炎患者，且 CINⅡ～Ⅲ级、浸润性鳞癌患者显著高于CINⅠ级患者，提示MCM2与Ki-67能准确地反映鳞状上皮细胞的增殖程度。

MCM2作为DNA复制许可蛋白和前复合物的重要组成成分，在DNA复制启动和DNA损伤修复中发挥着重要作用，其表达失调可导致细胞异常增殖与恶变倾向[8]。HR-HPV在宫颈癌前病变中发生、发展中起着重要作用，其通过E6、E7癌蛋白与抑癌蛋白P53和pRb结合及调控来明显改变细胞生长周期和影响DNA修复，从而促发癌变；E7蛋白降低了pRb的稳定性，而pRb减少会致p16的高表达导致细胞增殖而瘤变[9]。E6、E7癌蛋白也可与其他分子结合来破坏细胞增殖，并通过E2F转录因子途径介导的基因转录异常激活和异常S期诱导而致MCM2过表达，而p16过表达又会通过E2F转录因子介导的细胞周期异常激活途径使MCM2过表达而恶变[10]。本研究结果显示，MCM2与p16、Ki-67的表达均呈正相关，p16与Ki-67的表达呈正相关，故p16、MCM2、Ki-67三者之间的表达具有明显相关性，呈正相关。

综上，慢性宫颈炎患者、CIN患者及浸润性鳞癌患者宫颈组织中p16、MCM2、Ki-67均异常高表达，且三者阳性表达均与SIL病变严重程度正相关，p16、MCM2、Ki-67三者阳性表达也具有显著正相关性；提示将MCM2加入SIL病变的日常诊断中，可以使SIL，尤其是LSIL的病理诊断更精准，值得临床进一步深入研究。