橘子中维生素C稳定性的研究

何飞强，王尚贤，熊方永，张 英，丁健桦

(东华理工大学 化学生物与材料科学学院，江西 南昌 330013)

维生素C(L-抗坏血酸，简称VC)是一种重要的营养物质，是维持机体正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物，具有抗氧化、解毒、促进机体对钙、铁等人体必需元素的吸收作用，其主要的生理功能有促进胶原蛋白及结缔组织的合成、促进伤口愈合和增强机体免疫力、提高酶活性，预防癌症等(陈国峰等，2014；曾翔云，2005)。尽管VC对人体非常重要，但是人体缺乏古洛糖内酯氧化酶，不能自身合成VC，必须从天然食物、强化食品或药物中获取。但过多或过少摄入VC都不利于健康，严重时会引起病变等不良反应。如缺乏VC可引起坏血病；过量摄入VC会引起皮疹、结石、动脉硬化等疾病(陈莉，2012)。因此补充VC时应注意控制用量，根据国家卫生健康委员会发布的水溶性维生素摄入的卫生行业标准(中国营养学会，2018)，成年人对VC的日平均需要量(EAR)为85 mg/d、推荐摄入量(RNI)为100 mg/d，可耐受最高摄入量(UL)为2 000 mg/d；而未成年人对VC的摄入标准低于成年人，但即使一岁儿童其EAR、RNI、UL分别不低于35 mg/d、40 mg/d、400 mg/d。因此，对日常食物或药物中VC含量进行测定，使人们了解和控制自身VC摄入量非常重要。

目前VC测定的方法一般有滴定法、碘量法、比色法、荧光法、紫外分光光度法等(赵平娟等，2017)，这些方法具有试剂用量多、操作复杂等不足。高效液相色谱(HPLC)法则具有试剂用量相对较少、操作简单、省时省力，以及稳定快速、高效分离和运行自动化等优点(曹博等，2013；梁华正等，2012)，已经广泛应用于食品、药品中维生素、有机酸、氨基酸等的检测(Shahdousti et al., 2018; Pullar et al., 2018)。近十几年来，HPLC法测定VC含量的方法也得到了充分的发展和完善。

由于VC在常态下不太稳定，易被氧化(李军明等，2009)，易受温度、pH、光照等条件的影响(Ramesh et al., 2010)，因此结合日常生活经验，较系统地研究了时间、温度、光照以及厨房调味料和茶水等介质对VC稳定性的影响。本研究利用HPLC分析橘子中VC的含量，取得了比较满意的结果。不但可为人们根据营养需求合理选择和科学搭配果蔬提供科学依据，也可为果蔬中VC的保存、提取以及利用等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橘子、食盐、食醋和食用碱等调味料及茶叶均购于当地超市。

草酸(分析纯)、 天津市大茂化学试剂厂；VC(分析纯) 购于国药集团化学试剂有限公司；实验所用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪LC-15C (配有SPD-15C紫外-可见检测器和LC solution 15C色谱工作站，日本岛津公司)；循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，巩义市予华仪器有限公司)；数控超声波清洗器(KQ5200DB，昆山市超声仪器有限公司)；电子分析天平(BSA224S，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

(1)草酸溶液的配制。称取1.000 0 g草酸固体，用纯水溶解、转移至1 000 mL容量瓶中定容，得到0.1%的草酸溶液。

(2)标准储备液的配制。快速准确称取0.250 0 g VC标准品于100 mL的烧杯中，用0.1% 的草酸溶解，转移至250 mL棕色容量瓶中，并用0.1%的草酸溶液定容，得到1.00 g/L标准储备液，避光贮存，现配现用。

1.3.2 橘子样品溶液的制备

准确称取橘子果肉20.0 g，迅速切碎置于研钵中研成匀浆后迅速移入100 mL烧杯，再用25 mL移液管分两次准确移取25.00 mL 0.1%的草酸溶液清洗研钵，并将清洗液转移至上述烧杯中，精密称重，再将其置于超声波清洗仪中超声15 min辅助提取。超声后再精密称重，用0.1%的草酸溶液补重。随后溶液用0.45 μm滤膜过滤得到目标溶液。用移液管准确移取续滤液10.00 mL于50 mL容量瓶，用0.1%的草酸溶液定容得到橘子样品溶液。将该样品溶液超声5 min，过0.45 μm滤脱，进行HPLC分析。

1.3.3 调味料和茶水等溶液的制备

分别称取0.10 g食盐、食用碱和蔗糖标准品，用纯水溶解并分别转移至25 mL容量瓶中，再用0.1%草酸溶液定容，配成食盐溶液、食用碱溶液和蔗糖溶液；称取5.0 g普通茶叶于250 mL的玻璃杯中用开水封闭浸泡4小时制成茶水，再将上述配好的溶液以及购买的食醋分别用0.45 μm滤膜过滤，过滤后超声7 min。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Accurasil-C18柱；检测器：SPD-15C紫外-可见检测器(岛津，250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：255 nm；流动相：0.1%的草酸溶液；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.4 VC剩余率的计算

(1)

式中，A0为样品溶液中VC的起始含量；A为样品溶液在不同条件下所对应的VC含量。

2 结果与分析

2.1 VC的HPLC法测定

2.1.1 色谱条件的选择

根据相关文献(Klimczak et al., 2015; 王敬等，2014)同时结合VC的性质，色谱柱采用C18柱，选择0.1%的草酸作为流动相，其他条件分别为流速1.0 mL/min，进样量20.0 μL，检测波长255 nm。在该色谱条件下，浓度为1.00 mg/L的VC标准溶液的色谱图如图1所示。由图可见VC的峰形好且无VC的氧化物干扰峰，能满足VC分析的需求。

图1 VC标准色谱图Fig.1 Standard chromatogram of vitamin C

2.1.2 VC的线性精密度和检出限

用1.00 g/L的VC标准储备液稀释配制系列浓度的VC标准液，在所选色谱条件下进行HPLC检测。以VC峰面积对浓度绘制校准曲线，结果显示，在0.10～6.00 mg/L浓度范围内，VC标准溶液的线性回归方程为y=330 32x+3 233.3，相关系数R2为0.999 6，表明VC标准溶液在该浓度范围内线性良好。

将0.50 mg/L的VC标准溶液，在所选色谱条件下连续重复测定11次，得到VC检测精密度，再根据检出限计算公式LOD = 3σc/S(式中：σ为标准偏差，c为VC标准品浓度，S为相应信号强度的平均值)，计算出VC的检出限(表1)。从表1可以看出本法检测VC具有重现性好、检出限低等优点。

表1 VC检测的精密度和检出限Table 1 Precision and detection limits on the determination of vitamin C

2.1.3 样品测定和加标回收

将购买的同一批3个外表健康、颜色均匀的橘子分别标为1、2、3号样品，并按前述预处理的方法进行处理，然后进行HPLC检测，每个样品平行测定3次，结合标准曲线得到样品中VC浓度，再计算出每100 g该橘子所含VC的量(表2)，并将此数据作为下文探究橘子样品中VC稳定性的起始值。

表2 橘子样品分析结果Table 2 Results of analysis on orange samples

在体积均为50 mL的1、2、3号样品中分别添加150 μg的VC标准品，超声处理5 min后，每个样品平行测3次，得到加标回收率(表3)。

表3 橘子样品的加标回收率Table 3 Recoveries of orange samples

2.2 VC稳定性的探究

2.2.1 时间、温度和光照对VC稳定性的影响

将1、2、3号橘子样品剥开后分别在室温光照、室温避光和低温避光3个条件下放置0 h (即刚剥开时的检测结果，表2)、6 h、18 h、24 h后按前述方法进行处理和测定，检测对应的VC含量，考察VC随时间、温度和光照的变化情况。将橘子样品的VC含量随放置时间的变化做折线图(图2)。

实验过程中发现，1号样品搁置24 h后局部出现腐烂情况，而2号和3号样品依旧完好，故推断除了低温有利于防腐外，VC的散失也会加剧食品的腐烂，这跟VC的抗氧化性是一致的。即VC可能具有防腐的功能。

由图2可知，随着时间的增加，3个样品VC含量均减少了(放置24 h后减少35%以上)，但减少的程度各不相同。对比1、2号样品发现，光照会使VC加速分解；对比2、3号样品发现，低温能减缓VC的分解；对比1、2、3号样品发现，在避光和低温共存的条件下，VC分解最少。可见，为防止橘子中VC流失，应尽量将其保存至低温、避光环境中，且剥开后的橘子不应长期保存。

图2 橘子样品中VC含量随时间的变化图Fig.2 Changes in vitamin C quantity in orange samples over time

由图2可见，在0～24小时内，随着时间的延长，在各条件下VC含量均逐渐减少，且分解速率呈减缓的趋势。这可能是因为VC的分解大致包括两个过程(高晗等，2008)：第一个过程为抗坏血酸(还原态)氧化生成脱氢抗坏血酸(氧化态)和脱氢抗坏血酸还原生成抗坏血酸的过程，这个过程是可逆的；第二个过程是抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，而后直接进行不可逆分解的过程。因此，两个过程综合作用的结果是随时间延长，VC的分解逐渐达到平衡，分解速率会逐渐减缓，但是不存在VC不再分解的时间点。

假设橘子中VC以下列反应式降解：

nA→产物

(2)

根据VC降解的相关文献报道，VC的降解大部分呈现一级反应动力学模型。为此，本次研究进行相关验证，假设n=1。上式可简化为：

(3)

(4)

lnc=-kt+C1

(5)

式(2)至(5)中，r为VC的降解速率,mg/(100 g·h)；c为VC在任意时刻t的浓度,mg/100 g；k为降解速率常数；C1为常数。

通过对lnc-t作图，发现不同条件下的 lnc-t呈线性关系，且线性相关性较高，R2均在 0.97以上，这表明此反应符合一级反应模型，验证了橘子中VC符合一级反应降解规律。

结合图3中方程，得到1号、2号和3号样品中VC分解的速率常数k分别为0.024 18 h-1、0.020 44 h-1、0.019 44 h-1，该值直接反映了反应速率的快慢，对确定反应历程、设计合理的反应器以及保存运输等提供了重要依据。

图3 lnc与t线性拟合图Fig.3 Plots of lnc to t

2.2.2 调味料和茶水等介质对VC稳定性的影响

为了更加贴近生活实际，探究了食盐、食醋、食用碱、蔗糖等生活中常用调味料以及饮用水、茶水等对VC的影响。将食盐、食用碱、蔗糖、茶水等按1.3.3的方法配成溶液。分别将同批购买的6个橘子(依次编号为4、5、6、7、8、9号)按1.3.2的方法提取后，各取10.0 mL样品初始溶液，依次加入6个50 mL的棕色容量瓶中。然后分别加入饮用水、食盐水、食醋、食用碱溶液、蔗糖溶液、茶水5 mL，再用0.1%的草酸溶液依次定容，配成4至9号样品溶液。将这6种溶液在室内环境(室温，自然光)下搁置0 h (即起始测得值)、2 h、4 h、6 h时，在1.3.4的色谱条件下分别检测VC含量，再根据1.4中剩余率的计算公式求出0 h、2 h、4 h、6 h所对应的剩余率(表4)。

表4 调味料和茶水等介质对VC 稳定性的影响Table 4 Effect of seasoning and tea water on the stability of VC

由表4可知，饮用水、食盐、食醋、食用碱、蔗糖和茶水等介质对VC的分解有不同程度的影响。其中VC在碱性介质(如食用碱)中最易分解，中性介质(如饮用水)中次之、酸性介质(如食醋)中分解最慢。与饮用水相比，食盐溶液对VC分解影响不大；茶水对VC的散失具有较弱的加速作用，这是因为茶水虽然含有茶碱、咖啡碱、生物碱和胆碱等弱碱物质，但是也含有茶多酚等弱酸性物质，在这些物质的综合作用下茶水显很弱的碱性；蔗糖溶液对VC分解具有很大加速作用，可能是由于蔗糖是一种还原糖，它会与VC氧化产生的脱氢抗坏血酸发生氧化还原反应而被大量消耗的缘故(邱紫云等，2015)。

3 结论

建立了橘子中VC的HPLC测定方法，经方法学考察表明，该方法具有检出限低、精密度高、稳定性好等优点，可为橘子中VC含量的检测提供科学的分析方法。利用该方法，对VC标准样品进行分析，结果表明，VC浓度在0.10～6.00 mg/L范围内具有良好的线性关系，其线性回归方程为y=33 032x+3 233.3，相关系数R2为0.999 6，RSD为1.424%，LOD为0.087 mg/L；市售橘子中VC的稳定性研究结果显示，VC在低温和避光条件下比较稳定，在碱性介质中易被破坏，在酸性介质中较为稳定，在盐溶液中影响不大，而蔗糖溶液对VC的分解具有很大的加速作用，VC的分解呈现一级反应动力学规律。