光照强度与琼枝藻生长、光合色素和颜色值的相关性分析

童立豪，吴翔宇，黄良夫，曾 俊，石耀华，唐贤明

（1. 海南省海洋与渔业科学院/海南省热带海水养殖技术重点实验室，海南 海口 571126； 2. 广西科学院广西红树林研究中心/广西红树林保护与利用重点实验室，广西 北海 536007； 3. 海南大学海洋学院，海南 海口 570228）

琼枝藻 (Betaphycus gelatinae) 隶属于红藻门、真红藻纲、杉藻目、红翎菜科、琼枝藻属，俗称琼枝麒麟菜，主要分布于中国、菲律宾、日本、印度尼西亚等地，在中国自然分布于海南岛、东沙群岛和台湾岛等热带和亚热带海区[1-4]。自然界中琼枝藻主要附着在近岸岩礁、珊瑚礁等基质上生长，藻体背、腹面颜色差异明显，分别呈紫红色和黄绿色，枝扁平，分枝上有疣状突起。

作为中国海南特有土著海藻种类，琼枝藻具有重要的生态价值及较高的经济价值，被广泛应用于食品加工、卡拉胶提取等领域[5-7]。研究表明，琼枝藻藻体所含生物活性物质具有广谱病毒抑制[8-9]、抗凝血和抗血栓[8,10]、抗真菌[11]、抗炎症和抗肿瘤[12]等功效，可作为医药开发的良好材料。

当前琼枝藻野生资源极尽枯竭，呈现显著萎缩的趋势[13]，而人工养殖是解决原材料来源的主要途径[14]。数据显示，近年来琼枝藻养殖产量持续下降，2018年仅 1 820 t，比 2017年 (5 629 t) 减少67.67%[15]，这与海洋生态坏境破坏、海域使用空间减少以及研究基础薄弱等因素有关。我国早在1960年就开始了琼枝藻栽培研究，建立了较为成熟的养殖模式和种植技术[16]，但目前有关琼枝藻的研究仍较少，仅有营养成分[6]、卡拉胶提取[7]、药用价值[17]、环境因子对其生长的影响[14,16,18-19]等少量报道。因此，开展相关的基础研究，支撑和服务于养殖产业发展显得尤为重要。

光是影响植物生长发育、生理生化和形态建成等方面的重要影响因子，大型海藻在长期的自然进化过程中，形成了不同的光适应机制，不同种海藻对光照强度的需求不同。如石花菜 (Gelidium amansii)幼孢子体的适宜生长光照强度为 2 200～4 400 lx[20]；条斑紫菜 (Porphyra yezoensis) 的适宜生长光照强度为 6 600 lx[21]；瓦氏马尾藻 (Sargassum vachellianum)的适宜生长光照强度为 1 100 lx[22]。方哲等[18]以卤钨灯为光源研究了光照强度与琼枝藻生长的关系，认为琼枝藻在光照强度为3 000 lx时日生长率最高。童立豪等[23]研究了光质对琼枝藻生长和生理特性的影响，认为紫光和蓝光更有利于琼枝藻的生长。本文在前期工作的基础上，通过CSE-1成像色度检测分析系统，对光照强度与琼枝藻生长等生理指标的相关性进行了量化分析和探讨，以期为琼枝藻生物学研究及人工种植提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

琼枝藻取自海南省海洋与渔业科学院琼海科研基地 (110°40'07.2''E、19°21'58.2''N)，挑选颜色正常、生长旺盛的藻体洗净，于自然海水中暂养7 d后开始实验。暂养温度28 ℃，盐度28，光照强度5 000 lx，光周期为 12 L∶12 D。

1.2 实验设置

挑选健康无溃烂的琼枝藻 2～3 g (湿质量) 培养于 1 L 玻璃烧杯中。设置 1 000、3 000、5 000、7 000和 9 000 lx 共 5个光照强度，每个光照强度设置3个重复；采用多排密集日光灯管提供光照，通过距离远近调节光照强度。温度、盐度和光周期与暂养条件相同。每7 d换1次海水并称质量，实验持续 35 d。

1.3 生长速率和增重率计算

每7 d测量琼枝藻的湿质量，称量前用吸水纸快速吸干藻体表层水。根据以下公式计算增重率(Weight gain rate, WGR, %) 和相对生长速率 (Relative growth rate, RGR, %·d−1)：

式中：t为培养时间 (d)；M0为初始湿质量(g)；Mt为 t天后的湿质量 (g)。

1.4 色素和藻胆蛋白的提取和分析

实验第35天提取和分析藻体色素和藻胆蛋白质量分数。

叶绿素 a (Chl-a) 和类胡萝卜素 (Car) 采用无水甲醇提取法测定。根据Porra[24]的公式计算Chl-a的质量分数；根据Parsons等[25]的公式计算Car的质量分数。

藻红蛋白 (PE) 和藻蓝蛋白 (PC) 采用磷酸缓冲液提取法测定。根据Beer和Eshel[26]的公式计算PE和PC的质量分数。

1.5 颜色参数的测量与计算

实验第35天，用相机 (佳能EOS6D，日本) 对藻体进行无差别图片采集，后将待测图片导入CSE-1成像色度检测分析系统中，随机选取5个点，获得其相应的颜色参数 L*a*b*(CIE 1976) 和三刺激值 XYZ (CIE 1931) (L*为明度，数值介于0～100，a*指红绿色度，+ a*为红，– a*为绿；b*指黄蓝色度，+ b*为黄，– b*为蓝；X、Y、Z 分别指红、绿、蓝三原色值，表示颜色的光色度特性)。计算各处理组L*a*b*和XYZ的平均值，分别作为该藻体颜色参数和三刺激值，根据下列公式计算色品坐标x、y以及不同光照强度间藻体色差∆Eab：

1.6 统计分析

利用 Excel 2019和 SPSS 18.0软件进行数据处理及统计分析。采用One-way ANOVA (Turkey)和t检验分析显著性差异 (P<0.05)。光照强度、RGR、Chl-a、Car、PE、PC与L*a*b*之间采用Pearson相关性分析 (显著水平为P<0.05)。

2 结果

2.1 光照强度对琼枝藻生长的影响

光照强度为 1 000～9 000 lx 时，琼枝藻的RGR总体上随光照强度的增加而增大。光照强度为 1 000 lx时，琼枝藻的 RGR 仅为 (0.12±0.01) %·d−1，远低于其他光照强度组；光照强度为7 000与9 000 lx时，RGR 达到最大 (约 1.2 %·d−1) 且无显著差异 (P>0.05，图 1)。

图1 不同光照强度对琼枝藻相对生长速率的影响不同小写字母间表示差异显著 (P<0.05)。Figure 1 Effects of different light intensities on RGR of B. gelatinaeDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

光照强度为1 000 lx时，琼枝藻的WGR在实验期间无明显增加；其余各处理组生长变化趋势基本一致，实验前14 d生长较缓慢，第14—21天增长较明显，之后趋于稳定，WGR均随时间的延长逐渐上升。光照强度 7 000和 9 000 lx组的增重率变化曲线基本重合 (图2)。

图2 不同光照强度下琼枝藻增重率随时间的变化Figure 2 Change of WGR for B. gelatinae at different light intensities along with time

2.2 光照强度对琼枝藻光合色素质量分数的影响

随着光照强度的增加，琼枝藻的Chl-a质量分数逐渐下降。光照强度 1 000和 3 000 lx组的 Chl-a质量分数显著高于 9 000 lx 组 (P<0.05)，其余处理组间无显著差异 (P>0.05)。光照强度 9 000 lx 组的Car质量分数显著低于 3 000 lx 组 (P<0.05)，其余处理组间无显著差异 (P>0.05)，且 1 000、5 000和 7 000 lx组的 Car质量分数基本一致 (图 3)。

图3 不同光照强度下琼枝藻的色素质量分数不同小写字母间表示差异显著 (P<0.05)；不同大写字母间表示差异显著 (P<0.05)；图4同此。Figure 3 Pigment mass fraction of B. gelatinae at different light intensitiesDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).Different capital letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in Figure 4.

光照强度为1 000 lx时，琼枝藻的PE质量分数显著高于其他处理组 (P<0.05)，且随光照强度的增加逐渐下降，光照强度3 000 lx组的PE质量分数显著高于 5 000、7 000和 9 000 lx 处理组 (P<0.05)，后3个处理组间均无显著差异 (P>0.05)。各光照强度下的PC质量分数均较低，1 000 lx组较其他组高且差异显著 (P<0.05，图4)。

图4 不同光照强度下琼枝藻的藻胆蛋白质量分数Figure 4 Phycobiliprotein mass fraction of B. gelatinae at different light intensities

2.3 光照强度对琼枝藻颜色的影响

实验材料初始颜色均为红褐色。经35 d实验后，光照强度1 000 lx下琼枝藻颜色未发生变化，仍呈红褐色，与实验前藻体颜色无明显差异；光照强度3 000和5 000 lx下琼枝藻颜色呈浅红色，并逐渐偏向绿色；而光照强度7 000和9 000 lx下琼枝藻的颜色无明显差异，均为绿色 (图5)。

图5 不同光照强度下琼枝藻的颜色变化Figure 5 Color change of B. gelatinae at different light intensities

本研究显示，经35 d实验后，颜色均一的琼枝藻随光照强度的增加L*和b*总体上呈增大趋势，而a*则呈显著减小趋势 (表1)。L*介于26.14～50.64，光照强度为 9 000 lx时，L*最大；光照强度为 1 000 lx时，L*最小。a*介于−10.28～28.24，光照强度为 7 000和 9 000 lx时，色度均为绿色 (−a*)；其余光照强度下，色度为红色 (+a*)。b*介于12.49～34.25，各处理组的色度均为黄色 (+b*)；光照强度为 1 000 lx 时b*最小，光照强度为 7 000 lx 时b*最大。

表1 不同光照强度下琼枝藻的明度、红绿色度和黄蓝色度Table 1 L＊a＊b＊ values of B. gelatinae at different light intensities

不同光照强度下琼枝藻颜色的三刺激值XYZ集中在CIE 1931色度图上x为0.354～0.519、y为0.313～0.471。光照强度为1 000 lx时，主要分布在红原色区域，偏暗红色；光照强度为3 000和5 000 lx时分布在红原色和绿原色过渡区，偏向黄色；光照强度为7 000和9 000 lx时则主要分布在绿原色区域，偏亮绿色 (图6)。

图6 不同光照强度下琼枝藻的颜色色度图分布Figure 6 Distribution of XYZ on CIE color diagram for B. gelatinum at different light intensities

不同光照强度下各处理组间琼枝藻颜色的色差∆Eab最小为11.22，最大为50.57，且随光照强度差异的增大而增加 (表2)。

表2 不同光照强度下琼枝藻颜色的色差∆EabTable 2 ∆Eab values of B. gelatinae at different light intensities

2.4 琼枝藻颜色变化与光照强度、生长、光合色素的相关性

光照强度与L*呈显著正相关 (R=0.922,P<0.05)，与a*呈极显著负相关 (R=−0.997,P<0.01)。RGR 与L*呈显著正相关 (R=0.933,P<0.05)，与b*呈极显著正相关 (R=0.968，P<0.01)。Chl-a与L*呈显著负相关 (R=−0.883,P<0.05)，但与a*呈显著正相关 (R=0.952,P<0.05)；Car 与颜色参数L*a*b*均无显著相关性。PE和PC均仅与a*呈显著正相关 (P<0.05，表 3)。

表3 琼枝藻的颜色参数 (明度、红绿色度、黄蓝色度) 与光照强度、相对生长速率、光合色素的相关性Table 3 Correlation between L＊a＊b＊ values with light intensity, RGR and photosynthetic pigment

3 讨论

3.1 琼枝藻生长对光照强度的响应

植物通过光合作用合成有机物，满足自身生长的能量需要，而光照强度直接影响植物的光合生长，在长期的进化过程中，不同植物对光照强度有着不同的适应机制[27-28]。光照强度过低时会导致光合作用不足，影响藻类植物的正常生长，过高则会导致藻体产生过多的单线态氧 (1O2)，破坏藻体的光合色素和光合组织结构，最终影响其正常生长[29-31]。研究发现，长心卡帕藻 (Kappaphycus alvarezii) 绿色品系和红色品系对光照强度的需求差异明显，最适生长光照强度分别为 8 300和 1 600 lx[32]；真江蓠 (Gracilaria verrucosa) 随光照强度的增大生长速率逐渐增加，当光照强度为5 000 lx时生长速率最高[33]；芋根江蓠 (G. blodgettii) 的最适生长光照强度为9 000 lx[34]。本研究中琼枝藻的生长速率随光照强度的增加而增大，当光照强度达到5 000 lx后生长速率没有显著增加，表明琼枝藻在5 000～9 000 lx光照强度下均能快速生长。方哲等[18]研究显示光照强度为3 000 lx时，琼枝藻的日生长速率最高。造成这种差异的原因，可能是由于实验条件如材料处理、温度、盐度、光质等不同所致。方哲等[18]的研究用卤钨灯作为光源，而本研究以日光灯为光源，这也可能会影响同一光照强度下藻体的生长速率。

3.2 琼枝藻光合色素质量分数对光照强度的响应

红藻植物光合色素主要由Chl-a和藻胆蛋白组成，藻胆蛋白主要包括PE、PC和别藻蓝蛋白[35]。Chl-a和藻胆蛋白是光合作用的反应中心和捕光系统，藻胆蛋白捕获光能并传递给光系统Ⅱ，光能依次通过PE、PC、别藻蓝蛋白传递至Chl-a[36]。Chl-a和藻胆蛋白受环境因子尤其是光照强度的影响，在一定范围内，随着光照强度的增加，Chl-a、藻胆蛋白的含量下降[37]。本研究符合这一规律，经35 d培养后琼枝藻在低光照强度条件下Chl-a、类胡萝卜素和藻胆蛋白质量分数较高，并随着光照强度的增加而逐渐下降，这可能是琼枝藻应对不同光照强度的一种自我调节，通过增加光合色素含量，使其在光照强度不足时提高光能利用率，尽可能地满足自身生长对能量的需要。在方哲等[18]的研究中，Chl-a和藻胆蛋白含量总体变化与本研究相似，但其Chl-a含量显著低于本研究，而藻胆蛋白尤其是PE含量却远高于本研究，这种差异可能是由实验材料处理方法和实验光源不同造成，也可能是提取方法不同所致。

3.3 光照强度对琼枝藻颜色的影响及相关性分析

经35 d培养，肉眼观察和三刺激值XYZ在CIE 1931色度图中的散点图分析均显示，随着光照强度的增加，琼枝藻由红原色经黄色而最终趋于绿原色，光照强度对藻体的颜色有显著影响，与方哲等[18]的研究描述基本一致。本文采用颜色参数L*a*b*和CIE 1931色度图分析，更精准地体现了颜色差异与光照强度的关系。相关性分析显示，光照强度与L*呈显著正相关，而与a*呈极显著负相关；RGR与L*、b*均呈显著正相关；藻体颜色参数变化与光照强度、RGR具有较强的相关性和规律性，可通过测定藻体的颜色参数值来分析和判断藻体的生长状况，具有一定的准确性和科学性。颜色是色素等呈色物质的种类、数量和分布的综合体现，使植物显现出不同颜色[38-39]，这既与物种的遗传组成有关，也受光照等环境因子的影响[40]。琼枝藻的色素和藻胆蛋白含量变化可能是其在不同光照强度下呈现出不同颜色的重要因素。本研究显示，不同光照强度下琼枝藻颜色参数L*a*b*与Chl-a以及藻胆蛋白质量分数显著相关，表观颜色的变化是琼枝藻内部色素作用的结果，通过对藻体颜色参数分析，可对藻体内在色素的组成、含量等作出一定的判断。