对西花蓟马高效金龟子绿僵菌菌株筛选及在花生田间的应用效果

裴松松，吴 轩，李瑞军*，赵 丹，陆秀君，郭 巍

（1.河北农业大学植物保护学院，保定 071001；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

西花蓟马Frankliniella occidentalis隶属缨翅目Thysanoptera蓟马科Thripidae花蓟马属Frankliniella,是一种世界性的危险性害虫，广泛分布于全球69个国家及地区[1]，也是我国第一批重点防治的外来入侵物种[2]。西花蓟马在取食和产卵过程中，不仅直接为害寄主植物，还可以传播病毒病[3]，如凤仙坏死斑病毒（INSV）、番茄斑点病毒（TSWV）、番茄红斑病毒（TCSV）[4]和花生环斑病毒（GRSV）[5]，严重影响作物的品质和产量。西花蓟马的防治方法主要是农业防治和化学防治，其中化学防治是防治西花蓟马的主要手段。由于西花蓟马世代短，繁殖力高和孤雌生殖，以及大量化学杀虫剂的使用已导致西花蓟马对有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯和多杀菌素等多类杀虫剂产生了不同程度的抗药性[6,7]。

金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae是一种寄主范围广泛，对人畜、作物、害虫天敌及自然环境相对安全的虫生真菌[8]，其通过寄主体壁进行主动入侵感染，侵染过程包括寄主识别、附着孢分化、穿透体壁、免疫拮抗及体内定殖等过程，由多因素作用导致寄主死亡，以达到防治害虫的目的[9]。金龟子绿僵菌对西花蓟马的防治研究在国内外均有报道，Ansari等[10]研究发现，金龟子绿僵菌V275对西花蓟马的若虫、蛹和成虫均有较好的防治效果（致死率60%～90%），比化学农药吡虫啉或氟虫腈单独使用效果更好；Mburu[11]测定了18株虫生真菌的分离物对西花蓟马若虫的毒力，研究发现金龟子绿僵菌分离物ICIPE69的LT50最短，且分离物中分生孢子的数量最高；Maniania等[12]在田间试验中，比较了杀虫剂乐果与金龟子绿僵菌对洋葱上蓟马的防治效果，发现使用杀虫剂和金龟子绿僵菌均降低了蓟马虫口密度，每周使用金龟子绿僵菌最高产量为24000 kg/hm2，使用乐果产量最高为17000 kg/hm2。王兴民等[13]测定了甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、多杀菌素、绿僵菌素（金龟子绿僵菌产生的一类环缩羧肽类毒素）对西花蓟马2龄若虫的毒力，发现绿僵菌素对西花蓟马2龄若虫的毒力最高。出于高效野生菌株的相继分离和不同程度的田间防治效果，使人们对其寄予厚望。

我国是一个油料消费大国，也是油料进口大国。花生是我国主要的油料作物之一[14]。西花蓟马自2003年传入我国，已逐步蔓延至北京、云南、浙江、山东等地，本文采用室内毒力测定和田间药效试验（试验场地为河北农业大学农场试验基地）的方法，研究金龟子绿僵菌对西花蓟马的防治效果，研究结果对西花蓟马的生物防治有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试虫及菌株 供试西花蓟马为本实验室连续饲养昆虫，饲养条件为温度（25±1）℃，相对湿度（70±5）%，光周期16L:8D[16]，于20 cm×20 cm×20 cm养虫盒饲养，以新鲜四季豆饲喂，取成虫备用；供试黄粉虫为本实验室连续饲养昆虫，饲养条件（25±3）℃，于61 cm×41 cm×18 cm白色塑料盆饲养，以麦麸、新鲜蔬菜叶饲喂；供试23株金龟子绿僵菌采自河北及北京地区土样以土壤诱集法获得（表1），菌株保存与活化采用PDA培养基。

表1 供试金龟子绿僵菌的编号及地理来源Table 1 The serial number and origin of M.anisopliae for bioassays

1.1.2 田间试验药剂 供试化学农药见表2，优良菌株为试验中筛选得到的高毒力菌株F2-M18-8-4。

表2 试验中所用药剂Table 2 Pesticides used in the test

1.2 菌悬液制备

将菌株培养7 d后，用刮孢子器刮下所有孢子，加入0.05%吐温-80，在研磨器充分研磨后，倒入烧杯在漩涡振荡器上震荡3 min，利用血球计数板计数，配制成1×108个孢子/mL的菌悬液备用。

1.3 金龟子绿僵菌的初筛

采用浸虫法，用镊子将黄粉虫在菌悬液中浸没3 s，放入垫有滤纸的无菌培养皿中，每个处理15头试虫，重复 3次；试虫在人工气候箱饲养，温度（25±1）℃，相对湿度（70±5）%，光周期 16L:8D；连续10 d、每日记录死虫数，统计死亡率、毒力。

1.4 高毒力金龟子绿僵菌菌株诱变选育

以初筛获得高毒力菌株为出发菌株，将出发菌株接种于PDA培养基上，培养7 d待其产孢，用0.05%吐温-80配制成1×108个孢子/mL的孢子菌悬液，梯度稀释至1×106个孢子/mL。在超净工作台中，用功率15W的紫外灯预热30 min，取10 mL菌悬液加到直径为90 mm的无菌培养皿中置于磁力搅拌器上，距紫外线光源30 cm，照射5 min。取0.1 mL菌悬液到PDA培养基上均匀涂开，置于（25±1）℃培养箱内培养7 d后，进行室内毒力测定，从最早发病死亡的僵虫上分离、纯化得到菌株作为F1代菌株，继续按照上述方法，获得F2代菌株。

1.5 金龟子绿僵菌室内毒力测定

参照滤纸药膜法[17]，剪一片长方形无菌滤纸浸没在菌悬液中，取出后自然风干放入长10 cm，直径2 cm的塑料指形管中，将西花蓟马成虫移至指形管中并放入适量新鲜四季豆，以1×108个孢子/mL为浓度，测定了金龟子绿僵菌M18-8-4及其2株诱变菌株对西花蓟马的毒力。以0.05%吐温-80为对照，每个处理15头试虫，3个重复。每24 h观察一次存活状态，连续观察10 d，以软毛毛笔轻触虫体无反应判断为死亡，记录死虫数，统计死亡数、毒力。试虫饲养同1.3。

1.6 田间药效试验

种植花生品种为冀花-16，于4月中旬播种，穴间距为15 cm，行距为40 cm，花生生育期为苗期，试验期间不施用任何其他化学药剂。

将固液双相发酵获得的孢子粉，用含有0.05%吐温-80的水制成菌悬液。金龟子绿僵菌以药液用量30 L/667 m2喷雾，3种农药按照表2的用量。

试验前西花蓟马发生严重，每百穴（墩）花生西花蓟马虫口量达1000头左右。试验设4种药剂处理，以清水作为常规对照；每个处理设3个重复小区，共15个小区，小区随机排列，每小区面积约30 m2。6月21日傍晚，以电动式喷雾器均匀喷雾。施药前1 d及施药后3 d、7 d、10 d、15 d，采用5点取样法，每点调查5墩花生，记录西花蓟马的虫口量，同时调查花生新叶的受害程度。

花生叶片分级标准：0级，复叶叶片完好，无被害状；1级，复叶叶片受害面积0＜x＜6%；3级，复叶叶片受害面积6%≤x＜26%；5级，复叶叶片受害面积26%≤x＜51%；7级，复叶叶片受害面积51%≤x＜76%；9级，复叶叶片受害面积x≥76%[18]。

测产试验于花生收获前1 d进行调查，采用5点取样法，每点1 m2，称量并记录荚果重量[19]。

1.7 数据统计与统计

使用SPSS 17.0软件对室内毒力测定和田间药效试验进行数据分析[19-21]。

受害指数＝∑（各级受害叶数×相对级数值）/（调查总叶数×最高被害级）×100；保叶效果（%）＝（施药前受害指数—施药后受害指数）/施药前受害指数×100；校正保叶效果（%）＝(施药区保叶效果—清水对照区保叶效果)/（100—清水对照区保叶效果）×100；虫口减退率（%）＝（施药前虫口数量—施药后虫口数量）/施药前虫口数量×100；校正虫口减退率（%）＝（处理区虫口减退率—对照区虫口减退率）/（100—对照区虫口减退率）×100；增产效果（%）＝（药剂处理区产量—清水对照区产量）/清水对照区产量×100。

2 结果与分析

2.1 金龟子绿僵菌的初筛

空白对照的黄粉虫在 10 d的平均自然死亡率为 0，菌株 M18-8-4、M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19、M18-8-12、M18-8-7、M114造成黄粉虫累计死亡率达到100%（图1），显著高于其他菌株对黄粉虫的累计死亡率。生测中的虫尸在保湿培养下，绝大部分虫体在死亡2～3 d内长出白色菌丝，随时间延长，虫体逐渐布满绿色孢子。

各菌株对黄粉虫的致死中时 LT50在 3.68～19.36 d，不同菌株对黄粉虫的毒力差异显著，其中菌株M18-8-4的致死中时LT50最短，为3.68 d，虽然菌株M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19、M18-8-12、M18-8-7、M114对黄粉虫的累计死亡率也为100%，但致死中时LT50较长。其他菌株LT50显著长于M18-8-4对黄粉虫的LT50（图1）。通过初筛，选择致病力最高的菌株M18-8-4为优良菌株进行下一步试验。

图1 23株金龟子绿僵菌对黄粉虫10 d的累积死亡率和致死中时（平均值±SD）Fig.1 Cumulative mortalities and LT50 of 23 isolates against the T.molitor after 10 d treatment (Mean±SD)

2.2 金龟子绿僵菌对西花蓟马的毒力测定

金龟子绿僵菌M18-8-4及其紫外线诱变获得的F1、F2代菌株对西花蓟马成虫的毒力由高到低依次为菌株F2-M18-8-4、F1-M18-8-4、M18-8-4，致死中时分别为2.13 d、2.67 d、2.78 d（表3）。表明，诱变菌株F2-M18-8-4对西花蓟马成虫毒力高于其他菌株对西花蓟马成虫毒力。因此，选择菌株F2-M18-8-4作为田间药效试验的高毒力菌株。

表3 出发菌株和诱变菌株对西花蓟马的毒力测定结果Table 3 Results of toxicity test of starting strain and mutant strain to F.occidentalis

2.3 对西花蓟马的田间防治效果

2.3.1 对西花蓟马的校正虫口减退率 为验证金龟子绿僵菌 F2-M18-8-4的防治效果，以田间防治西花蓟马常用3种化学农药为参照，进行田间药效对比试验。4种处理对西花蓟马均有一定防治效果。施药3 d后，金龟子绿僵菌F2-M18-8-4对西花蓟马的校正虫口减退率显著低于3种化学农药，吡虫啉、噻虫嗪和乙基多杀菌素对西花蓟马的校正虫口减退率分别达到66.48%、56.15%、62.47%；施药7 d、10 d后，各处理对西花蓟马的校正虫口减退率无差异，金龟子绿僵菌 F2-M18-8-4对西花蓟马的校正虫口减退率分别为67.19%、68.73%；施药15 d后，金龟子绿僵菌F2-M18-8-4对西花蓟马的校正虫口减退率显著高于3种化学农药，为79.52%（表4）。可见随着时间的延长，金龟子绿僵菌F2-M18-8-4对西花蓟马的校正虫口减退率呈上升趋势。

表4 各处理对西花蓟马施药后不同天数的校正虫口减退率Table 4 The corrected decrease rate of F.occidentalis on different days after different treatments application (%)

2.3.2 对花生的校正保叶效果 金龟子绿僵菌F2-M18-8-4和3种化学药剂对花生校正保叶效果如表5所示。施药3 d后，吡虫啉和噻虫嗪对花生的校正保叶效果最高，分别为48.18%、42.01%，与金龟子绿僵菌F2-M18-8-4校正保叶效果有显著差异；施药10 d后，吡虫啉对花生的校正保叶效果最高，达61.76%，其次为金龟子绿僵菌F2-M18-8-4和噻虫嗪，校正保叶效果分别为58.61%、56.02%；施药15 d后，金龟子绿僵菌F2-M18-8-4的校正保叶效果最高，达63.58%，其次为乙基多杀菌素58.11%，吡虫啉和噻虫嗪校正保叶效果较差。

表5 各处理施药后不同天数对花生的校正保叶效果Table 5 Corrective peanut leaf protection rate at different days after different treatments application

2.3.3 不同处理防治西花蓟马对花生增产效果 金龟子绿僵菌F2-M18-8-4防治西花蓟马花生的产量最高，为6034.20 kg/hm2，增产效果为9.09%；其次是乙基多杀菌素处理的产量为5940.90 kg/hm2，增产效果为7.40%，两者间差异不显著。吡虫啉和噻虫嗪处理增产效果较差，与金龟子绿僵菌处理间有显著差异，与乙基多杀菌素处理间差异不显著（表6）。

表6 不同处理防治西花蓟马后对花生的增产效果Table 6 Effect of different treatment on peanut production by controlling F.occidentalis

3 讨论

利用黄粉虫筛选虫生真菌是一种经典的筛选方法，在初筛中毒力及死亡率均较高的M18-8-4、M18-8-6、M18-8-5、M18-8-19等菌株中，菌株M18-8-4对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela、西花蓟马、棉铃虫Helicoverpa armigera、花生蚜Aphis medicaginis和甜菜夜蛾Spodoptera exigua等花生田主要害虫均显示较高毒力，本文主旨报道诱变菌株 F2-M18-8-4对西花蓟马的防治效果，其他试验结果将另行报道。诱变后的真菌，其在人工培养基传代后生物学性状和杀虫活性的稳定性都是值得关注的问题，也是保证后续研究应用的前提，本试验紫外线诱变后，选取生长性状好的单菌落经培养后进行毒力测定，再从毒力高、僵虫菌丝致密、分生孢子产量大的虫体上分离、纯化新菌株，以确保其毒力、抗紫外线能力及生长特性稳定。

西花蓟马是典型的多食性害虫，可为害包括豆科植物花生在内60多个科500多种植物[22]，对花生的产量造成严重影响[14]。田间害虫调查中发现西花蓟马、花生蚜和甜菜夜蛾3类害虫，其中以西花蓟马种类数量最多且危害严重，每百墩花生西花蓟马虫口量达 1082头，目前，西花蓟马已对多种化学农药产生不同程度的抗性，万岩然等[23]发现在北京地区与室内敏感品系相比，西花蓟马田间种群对多杀菌素的抗性倍数达到80～150倍；对乙基多杀菌素抗性倍数高达7730倍；对乙基多杀菌素的LC50值5年间最高增加了258倍；对甲维盐和噻虫嗪具有中等水平抗性；对阿维菌素和虫螨腈处于敏感或低水平抗性。故此，田间害虫发生时应优选生物防治，如杀虫真菌金龟子绿僵菌[10-13,24,25]、球孢白僵菌Beauveria bassiana[26,27]，捕食性天敌昆虫巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri[28,29]、南方小花蝽Orius similis Zheng[30,31]等都应用于防治西花蓟马。金龟子绿僵菌对西花蓟马有较高毒力，Taro[25]发现在室内条件下，不同菌株引起的死亡率为 0～15.98%，表明筛选高毒力菌株是提高防治效果的主要途径。本试验通过生测和紫外诱变，选育得到对西花蓟马毒力较高的金龟子绿僵菌F2-M18-8-4。以3种化学农药为对照，田间药效试验表明，施药10 d后，金龟子绿僵菌F2-M18-8-4对西花蓟马的校正虫口减退率达68.73%，与3种化学农药相当，施药15 d后，金龟子绿僵菌无论在对西花蓟马的校正虫口减退率还是对花生的保叶效果上，均显著高于3种化学农药。试验结果显示，金龟子绿僵菌防治西花蓟马有较好的应用前景，生产上可与化学农药交替、轮换使用，以减少化学农药残留并延缓害虫抗药性的发展。

在田间应用过程中，紫外线、温度和湿度都会影响绿僵菌的防治效果，绿僵菌在较强紫外线的照射下会失去活力[32]。本试验选择在傍晚施菌，避开了较强的日光直射，为孢子萌发提供较适宜的环境条件。西花蓟马对于寄主植物的危害是多方面的,仅仅用虫口数量不能充分反映其影响[33]；绿僵菌可以兼治寄主植物的多种害虫[34]，如果每一种都调查虫口减退情况，工作量将十分巨大；本试验以保叶效果评价各处理的防治效果，不仅减少了田间工作量，还可以综合评价各处理总的保护作物的效果。

在田间试验中，基于金龟子绿僵菌侵染、发病过程，在施药初期金龟子绿僵菌 F2-M18-8-4对西花蓟马的防治效果显著低于化学农药。有相关研究表明，绿僵菌与某些化学农药联合使用，可以提高防治效果[35]，我们将继续研究金龟子绿僵菌 F2-M18-8-4与化学农药协同使用的方式和效果，以期提高防治西花蓟马的效果。