免疫沉淀法与质谱联用检测RHD蛋白序列方法学的建立*

钟福铃 梁延连 苏宇清 吴凡 梁爽 张海璇 洪文旭 徐筠娉

Rh血型在临床输血中的重要性仅次于ABO血型，Rh抗原是由染色体1p 3 4-p 3 6上两个同源基因RHD和RHCE（序列同源性为96%）编码的膜蛋白，其属于非糖基化疏水跨膜蛋白的一个家族，这两个基因很可能是由一个共同的祖代基因复制而来。Rh血型抗原至少由三种非同源的膜蛋白（RHD、RHC/c、RHE/e）携带，它们的分子量在30 000至32 000之间，但其不是糖基化蛋白[1-2]，而是红细胞膜上一种脂肪酰化的化学成分[3-4]。RhD抗原是具有复杂多态性的抗原，其变异体在输血医学中具有极其重要的意义，如弱D表型曾被称为Du型，和正常RhD阳性红细胞上的D抗原相比，弱D表型红细胞D抗原质量未改变，只是数量减少，抗-D血清有时无法鉴定出D抗原导致误判血型[5]。本研究通过应用免疫沉淀法[6]与质谱技术[7]检测RHD蛋白的氨基酸序列可以获取最大量的人类红细胞膜RHD蛋白序列信息，对存在RHD基因但血清学未检测到RhD抗原的红细胞进行精确定型，同时为进一步探讨RHD基因调控RhD抗原在红细胞上的表达奠定基础。

资料与方法

1 试剂 R I P A蛋白裂解液（RIPA Lysis and Extraction Buffer，Thermo Fisher Science）、B C A蛋白定量试剂盒（Pierce™ BCAProtein Assay Kit，Thermo Fisher Science）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT，PlusOne）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAA，Sigma）、胰蛋白酶（Trypsin，Promega，V5280）、胰酶重溶液（Trypsin resolve solution，Promega，V530）、碳酸氢铵（Ammonium bicarbonate，Sigma A6141）、甲酸（FA，Sigma）、乙腈Acetonitrile（Fisher）、甲醇methanol（Fisher）、Rh抗-D血清。

2 仪器 Obitrap Q Exactive mass spectrometer（Thermo Fisher Scientific，USA）、多功能酶标仪（MDParadigm），Concentratorplus真空离心浓缩仪（Eppendorf），SartoriusBP 2 1 1d分析天平（Sartorius），高速离心机（Thermo Fisher Scientific）。

3 研究对象 随机选取10例已知RhD阳性的无偿献血者的抗凝血5 mL（本研究经深圳市血液中心伦理委员会批准，文中所涉及献血者均已被告知实验内容并由本人签署知情同意书），其中血型定型分别为：RhCCDee（3例）、RhCcDEe（5例）、RhccDEE（2例）。

4 检测方法

4.1 蛋白质提取：①取红细胞样品100 µL加入1 mL预冷的Lysis Buffer，使用超声破碎仪破碎细胞，超声2 s暂停2 s，共超声10 min。②4℃ 14 000 g离心15 min，立即将上清液转移到新的离心管中。

4.2 BCA法蛋白质定量：①配制浓度为0.0 2 5、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500、2.000（µg/µL）的标准品溶液，并将样品稀释50倍备用。②分别取25 µL标准品及样品于微孔板中，每孔中加入200 µL工作试剂。在微孔板振荡器上混合30 s后，37℃孵育30 min。③冷却至室温后，在多功能酶标仪上测量562 nm处的吸光度。制备标准曲线，并计算样品浓度。

4.3 免疫沉淀：①准备Protein A agarose，用PBS洗两遍琼脂糖珠，然后用P B S配制成5 0%浓度。②每1 mg总蛋白中加入100 µL Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插于冰上，放置水平摇床），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。③4℃ 14 000 g离心15 min，将上清液转移到新的离心管中，去除Protein A琼脂糖珠。④用PBS将总蛋白稀释到约1 µg/µL，以降低裂解液中去垢剂的浓度。⑤加入200 µL Rh抗-D抗体到500～1 000 µg总蛋白中，4℃缓慢摇动抗体和细胞裂解液混合物过夜。⑥加入100 µL的Protein A琼脂糖珠捕捉抗体及其结合的蛋白，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜。⑦在14 000 g瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗体复合物，去上清，用800 µL预冷的PBS buffer洗涤3遍。

4.4 蛋白酶切：①用50 mmol/L NH4HCO3溶液清洗protein A beads两次，将beads分散于100 µL 50 mmol/L的NH4HCO3溶液。②加入DTT溶液使其终浓度为10 mmol/L，于56℃水浴中还原1 h。加入IAA溶液使其终浓度为50 mmol/L，避光反应40 min后，加入DTT溶液使其终浓度为20 mmol/L中和过量的IAA。③按照胰蛋白酶与底物质量比为1∶100加入胰蛋白酶，37℃酶切4 h，继续按质量比1∶100加入胰酶，37℃酶切反应过夜（16 h）。④使用自填脱盐柱脱盐后，于45℃真空干燥备用。

4.5 质谱鉴定分析：①肽段用样品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解，充分振荡涡旋，13 200 r/min，4℃离心10 min，上清液转移到上样管中进行质谱鉴定。②色谱信息，预柱300 µm i.d.×5 mm， packed with Acclaim PepMap RPLC C18，5 µm，100 Å；分析柱75 µm i.d.×150 mm，packed with Acclaim PepMap RPLC C18，3 µm，100 Å；流动相A，0.1%甲酸，2%CAN；流动相B，0.1%甲酸，80%CAN；流速300 nL/min；每个组分析时间60 min。③分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测，一级质谱参数，Resolution 70 000，AGCtarget 3e6，MaximumIT 40 ms，Scanrange 350 to 1 800 m/z；二级质谱参数，Resolution 17 500，AGCtarget 1e5，MaximumIT 60 ms，TopN 20，NCE/steppedNCE 27。

4.6 数据库检索：质谱原始文件，Max Quant[8]（1.5.6.5）检索目标蛋白及uniprot-Human数据库，检索参数①固定修饰（Fixed modifications），Carbamidomethyl （C）。②可变修饰（Variable mod if ications），Oxidation （M）。③酶（Enzyme），Trypsin。④遗漏酶切位点（Maximum Missed Cleavages），2。⑤一级质谱误差（Peptide Mass Tolerance），2 0 p p m。⑥二级质谱误差（Fragment Mass Tolerance），0.5 Da。⑦肽段/碎片离子质量数（Mass values），Monoisotopic（单同位素）。⑧显著性阈值（Significance threshold），0.05。

结 果

1 蛋白浓度检测 根据配制已知浓度的标准品溶液得到蛋白浓度的标准曲线，见图1。

使用免疫沉淀法提取红细胞上的RHD蛋白，通过标准曲线可以计算出10例标本的RHD蛋白浓度，见表1。

2 蛋白鉴定结果

2.1 目标蛋白搜库结果：将鉴定到RHD蛋白的目标肽段与参比序列GenBank AEY68242.1进行比对，发现所检测到的10例样本的RHD蛋白序列与原参比序列的吻合度均达到100%，见表2。

表2 1～10号样本鉴定到的RHD蛋白氨基酸长度、肽段数与原参比序列的吻合度

2.2 鉴定肽段二级图谱：10例样本均获得了不同肽段碎片离子，每例样本检测到的肽段离子组合得到该样本的红细胞膜RHD蛋白肽段二级图谱，选取1例样本的肽段二级图谱作为代表图，如图2所示。

图2 红细胞膜RHD蛋白肽段二级图谱代表图

红细胞膜在低温与超声破碎仪的作用下裂解，通过特定抗-D抗体的免疫沉淀作用提取到高浓度的RHD蛋白。利用蛋白质质谱（MS）技术可以将检测到的肽片段序列在数据库中进行鉴定。此外，质谱技术还可以处理任意多碎片的肽段数据，能够对翻译后修改的复杂模式（如高度磷酸化的肽）进行赋值和评分。MaxQuant计算蛋白质组学平台具有识别多肽段的能力，在检测RHD蛋白方面具有显著的优势。

讨 论

RHD蛋白包括RHD和RHCE蛋白，两者的多肽链结构相似并具有高度的同源性[9]。此外，还有另一种蛋白Rh50，称为Rh相关蛋白（RHAG），RHAG与RHD、RHCE的氨基酸序列存在32.9%、38.5%的相似性，三者之间有12个相似的跨膜结构域[10]。RHAG蛋白不具有血型系统的多态性，即不产生血型抗原，但它可以辅助RHD及RHCE蛋白固定在红胞膜上，形成RHD蛋白复合体。RHAG蛋白还参与RHD抗原的缺失和表达[11]。通过对红细胞上RHD蛋白的分析研究，我们可以精确鉴定RhD血型，同时可以更深入地了解RHD蛋白的功能与RhD抗原在红细胞上的表达以及相关RH蛋白家族之间的联系。

本研究应用免疫沉淀法通过特异性抗-D抗体与红细胞上的RhD抗原结合并形成沉淀物，通过Protein A的作用来纯化及捕捉抗体及其目标蛋白。使用Promga公司生产的胰蛋白酶进行一步法酶切得到特异性RHD蛋白肽段，再通过质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测得到相关质谱参数。所有的参数通过Maxquant软件进行Protein ID分析得到目标蛋白的显著性阈值，制备出实验样品RHD蛋白定量的标准曲线，通过标准曲线可以计算出每一例样本的RHD蛋白浓度。Uniprot-Human数据库中检索到RHD蛋白的氨基酸序列，在NCBI的BLAST Genomes上与人类RHD蛋白参比序列比对发现检测到的蛋白肽段与RHD蛋白的氨基酸序列完全吻合。结果表明，特异性的免疫沉淀法与质谱联用是一种获得高纯度RHD蛋白的可靠方法，用针对RHD蛋白的抗-D抗体在胰蛋白酶的作用下可以纯化目标蛋白组分，从肽段的二级图谱中可以看到质谱相对于基峰的离子峰度较明确，氨基酸序列的长度与峰值成正比，可有效检测RHD蛋白的序列。Rh血型抗原系统是非常复杂的血型系统，有人认为，不同的Rh血型抗原的产生是Rh mRNA选择性剪接的结果[12]，选择性的剪接造成了个体间Rh抗原表达的差异。Rh血型因种族不同而有差异，亚洲地区的Rh阴性族群中有30%是带有完整RHD基因的DEL血型，但其D抗原表现微弱甚至无法用传统血清学方法测出，须通过吸收与放散试验或敏感性更强的流式细胞技术才能检测到[13-14]，也有通过基因测序的方法来鉴定RhD血型[15]。但这些方法均存在实验操作的主观性影响，或方法学本身的局限性会影响实验结果的可靠性，例如吸收放散方法会受吸收时间、温度、洗涤红细胞次数甚至盐水的洗涤量、放散试剂等影响。基因测序的分析结果只能说明RHD基因的存在，不一定能说明红细胞表面RhD抗原的表达量。因此，本研究建立的方法能直接鉴定红细胞膜上RHD蛋白是否存在，说明了Rh抗原在红细胞上的表达与RHD基因具有直接的相关性。

免疫沉淀法与质谱联用技术可以准确检测人类RHD蛋白的氨基酸序列，为RhD血型的精确定型以及RHD基因与抗原表达的研究打下基础，进一步为RHD蛋白对应的抗原多态性、功能以及结构的深入研究提供帮助。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突