有机小分子荧光探针的设计及其在酶类肿瘤标志物检测中的研究进展

段新瑞，孟天姣

(陕西师范大学 化学化工学院，陕西 西安 710119)

癌症是机体在许多致瘤因素作用下，细胞生长增殖机制失常后发生无限增殖而引起的疾病，是人类死亡率较高的疾病之一[1-2].临床研究结果表明, 肿瘤标志物检测可作为判断疾病发生的生物学依据，因此肿瘤标志物检测是诊断和跟踪癌症的首选方法.许多潜在的疾病标志物中，生物酶是由生命体内的活细胞产生的具有催化活性的蛋白质[3-5].荧光成像技术在生物成像分析与疾病诊断与治疗领域展现出了巨大的应用潜力[6-9]，它依赖于成像探针的发展.荧光探针用于肿瘤标志物检测具有多种优点, 如操作简单、无创、实时成像、经济、快速响应等.其中有机小分子荧光探针具有易于修饰、易于调节光谱、生物相容性好且易于被生物体代谢等优点, 已广泛应用到细胞成像、分子标记和实时成像等方面[10-13].本文主要综述了近些年新型有机小分子荧光探针在2种肿瘤标志物检测中的研究进展.

1 肿瘤标志物

恶性肿瘤是世界范围内死亡率较高的疾病之一.正常机体细胞在致癌因素的驱使下，能够转变为癌细胞从而无限增殖.癌变的细胞能够在身体不同部位之间进行转移，从而引起机体器官、组织结构和功能的损坏[14-16].因此，对恶性肿瘤及早发现、确诊和针对性治疗是治疗恶性肿瘤的最有效方法.肿瘤标志物是肿瘤细胞宿主对癌细胞所产生的可反映癌变细胞本身特征的化学物质.肿瘤标志物与肿瘤的进化发展阶段息息相关，从而引起了越来越多研究者们的关注，其主要的形式有核酸分子、抗原、酶、糖蛋白、激素等[17-21].这些分子的活性水平会因在患者体内的异常表达而显著提高[22-24].临床研究结果表明，肿瘤标志物检测可作为判断疾病发生的生物学依据，因此肿瘤标志物检测是诊断和跟踪癌症的首选方法.

在许多潜在的疾病标志物中，生物酶是由生命体内的活细胞产生的具有催化作用的有机物.大量研究表明，某些生物酶的异常表达与多种癌症的发生息息相关.碱性磷酸酶(ALP)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、硝基还原酶(NTR)、乙醛脱氢酶(ALDH)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、谷氨酰转肽酶(GT)以及端粒酶(TE)等都是较为常见的酶类肿瘤标志物[25-31].随着研究的不断深入，相关生物酶的活性水平开始成为肿瘤早期诊断的重要指标之一.其中，ALP是一种广泛存在于生物组织中的膜结合酶，在核酸、蛋白质和其他底物的磷酸水解中起着重要作用[32-33].研究表明，ALP水平异常表达与许多癌症的发生和发展有关，例如，在淋巴瘤、前列腺癌、肝癌和骨肿瘤中可观察到 ALP 活性水平明显升高[34-36].ALP被认为是各种癌症的潜在靶点，因此，实现对 ALP 活性的高灵敏度和选择性实时监测对相关疾病的诊断具有重要意义.NTR是最具代表性的缺氧酶之一，其在恶性肿瘤进展、转移、侵袭和血管生成中起着巨大的作用，因此，NTR被认为是各种缺氧肿瘤细胞中的关键标志物[37-39].此外，NTR还参与了解毒、促进药物活化以及放射治疗等基本过程[27, 40].因此，NTR的检测对于肿瘤治疗和药物发展起着非常重要的作用.

2 荧光成像概述

随着对光在生物组织中传播规律的深入研究，光学技术在混浊介质(生物组织)研究中已显现出其特有的优势.光学成像技术具有非接触性、无损伤、高灵敏度和高分辨率等优点，可对生物分子、细胞、组织和生物体，进行实时、多维的可视化监测，因此，广泛应用于生物分子检测成像、药物分布代谢跟踪、疾病检测和诊断的研究[41-44].近年来，随着荧光成像技术的发展，临床上也用其区分正常组织与病变组织以指导外科手术切除，在生物医学领域展现出了巨大的潜力[45-49].

荧光成像的发展依赖于成像探针的发展.迄今为止，已经开发了多种荧光探针，例如荧光蛋白[50-51]、量子点[52-53]和有机荧光染料[54-56].随着荧光探针的发展，荧光探针用于肿瘤标志物检测显示出了许多优点，如操作简单、无创、实时成像、经济、快速响应等[57].有机荧光探针，包括聚多巴胺纳米颗粒[58-59]、有机小分子荧光探针[60]和荧光共轭聚合物及其纳米粒子等，因其可设计性和合成可控性在荧光成像方面的应用发展迅速[61-62].其中，有机小分子荧光探针具有易于修饰、易于调节光谱、生物相容性好且易于被生物体代谢等优点，已广泛应用到细胞成像，分子标记和实时成像等方面[63-64].

3 有机小分子荧光探针在不同肿瘤标志物检测中的研究进展

如图1，有机小分子荧光探针通常由荧光团(fluorophore)、连接臂(spacer)和识别基团(receptor)3部分构成.其中，荧光团能够在吸收光能后发出荧光信号，识别基团用于目标分析物的识别，在与目标分析物发生特异性结合后将信息传递给荧光基团，使探针分子的性质发生改变.常见的有机小分子荧光探针主要分为可见光区小分子荧光探针和近红外光区小分子荧光探针.

图1 有机小分子荧光探针的结构示意Fig.1 Structure schematic of organic small molecule dyes

3.1 可见光区小分子荧光探针生物酶检测

常见的可见光区小分子荧光探针有荧光素、查尔酮、香豆素和罗丹明等.其中，荧光素是最常见的有机小分子荧光探针之一，具有高的量子产率和较高的灵敏度，其衍生物已成功应用于多种生物分子活性水平的检测[65-66].罗丹明类染料具有刚性平面以及很强的荧光[67-68].更重要的是，罗丹明染料对细胞没有任何毒性.香豆素是一种具有抗癌、抗增殖、抗氧化、抗真菌等优点的有机荧光探针，其本身没有荧光，它的光学性质可以由可改变的π共轭部分而调整得到[69-70].查耳酮(α，β-不饱和酮)属于黄酮类化合物中的一种，具有独特的柔性分子结构,电子给体和电子受体基团修饰的查耳酮是由于其π共轭的骨架面而具有强发射性，其可以在生物体内与多种体内代谢物进行结合[71-72].因此，查耳酮是一种很有前途的荧光探针发光支架材料.

Zhu等[73]报道了一种新的基于查尔酮的荧光探针(Pycl-NO2)并将其应用于内源性NTR的检测(图2a).查耳酮衍生物具有中央酮基团，其作为荧光发射染料具有接受电子的特性.该探针利用了基于荧光体上的硝基直接还原为氨的反应机理，Pycl-NO2上的硝基是强的荧光淬灭基团，因此这类探针其本身几乎没有荧光，当吸电子基团硝基被酶还原为供电子基团氨基时，这种拉-推效应的转换将极大地改变荧光体分子内的电子云分布或电子环境，从而导致光学信号的显著改变，该探针表现出对NTR的敏感性和选择性的开启荧光反应，其检测限为27 ng/mL.此外，该探针已成功应用于肿瘤细胞中的缺氧成像，为肿瘤预诊断提供了有用的工具.3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮(DFHBI)是绿色荧光蛋白(GFP)类荧光团的小分子，已被广泛用于感测生命系统中的各种生物分子. Duan课题组[74]设计并开发了基于GFP的RNA模拟的双激活的荧光探针(DFHBI-NF)，用于检测细胞内源性NTR(图2b).基于多米诺分解反应，当NTR与探针上的硝基发生还原作用时，会发生电子重排以及碳氧键的断裂反应，从而释放出荧光团并导致光学信号的改变.此外，由于使用RNA来标记细胞，该探针仅在标记后的细胞中且存在NTR时发出荧光.因此，该检测系统为基于RNA/DFHBI络合物开发各种遗传编码的荧光生物传感器提供新的可能性.Lee等[75]开发了一种自校准的双组分荧光探针，由NTR敏感的硝基萘酰亚胺和非敏感的香豆素组成(图2c).同样是利用了基于荧光体上的硝基直接还原为氨的反应机理.通过监测非癌细胞和某些癌细胞的荧光比值，可以比较NTR的相对活性，并证实NTR活性升高与癌细胞和缺氧状态有关.

图2 Pycl-NO2(a)和DFHBI-NF(b)香豆素基-NTR(c)NTR-AHC(d)体内内源性NTR检测示意Fig.2 Schematic diagram of Pycl-NO2 (a),DFHBI-NF (b), coumarin-NTR (c) and NTR-AHC(d)in detecting endogenous NTR in vivo

传统的荧光探针大多基于单一分析物的检测，而近年来许多团队已开发出用于双分析物或多分析物同时探测的荧光探针，从而提升医学诊断的精准性.Tian等[69]开发一种基于香豆素的新型荧光探针(NTR-AHC)用于同时检测生物硫醇和NTR(图2d).该探针在谷胱甘肽(GSH)和NTR同时存在下，在463 nm处产生了增强的荧光.

此外，具有聚集诱导发射(AIE)特性的荧光探针在生物传感应用中引起了越来越多科研人员的兴趣，特别是具有特异靶向性的荧光探针.与由于π-π堆积相互作用而在高浓度或固态下遭受荧光淬灭的常规荧光团不同，AIE荧光团(如四苯基乙烯(TPE))在聚集时，会产生增强的发射，由于它们独特的螺旋桨状结构，因此它们的分子内旋转受到聚集状态的限制，进而阻止了通过非辐射通道的能量消散，从而导致了高量子产率[76-77].Liang等[78]合成了具有AIE特征的磷酸修饰四苯基乙烯荧光探针(TPE-phos)，用于检测ALP及其酶活性(图3a).与之前TPE基荧光探针工作相比[79-80]，在 ALP 存在下，与TPE-phos上的磷酸基团识别并使其裂解，产生具有2个羟基的不溶性 TPE 残基 (TPE-2OH).由于分子内旋转机制受到限制，使其在水介质中的荧光信号可以忽略不计，因此获得了较高的信背景比，检出限0.2 U/L.Zhang等[81]设计的高灵敏度的ALP荧光探针(TPEQN-P)，利用特异性AIE效应也实现了ALP的检测及其抑制剂的筛选(图3b).由于TPEQN-P具有良好的水溶性，使其在水性介质中表现出非常弱的发射.当 ALP 存在的情况下，TPEQN-P 发生去磷酸化并释放出水解产物 TPE-QI，由于其水溶性较差，因此具有强烈的荧光特性，使其检出限可低至0.007 7 U/L.同时，TPEQN-P在血清样品中也显示出良好的适用性，因此在临床诊断和生物医学研究中显示出潜在的应用价值.

图3 TPE-phos(a)和TPEQN-P(b)体内内源性ALP检测示意Fig.3 Schematic diagram of TPE-phos (a) and TPEQN-P (b) in detecting endogenous ALP in vivo

3.2 近红外(NIR)荧光探针生物酶检测

近年来，近红外(NIR,650～1 700 nm)荧光探针以其独特的优势受到研究者的青睐.NIR荧光探针具有较长的激发和发射波长，较低的能量，更深的组织渗透性以及减少的自荧光背景干扰，已被广泛应用于实时监测生物组织的光学成像方面[82-83].NIR小分子荧光团包括菁染料、卟啉衍生物、角鲨烯衍生物、BODIPY类似物和黄嘌呤等.其中菁染料(如Cy3、Cy5、Cy7、IR780和IR1048等)，具有摩尔吸收系数大、细胞毒性小和荧光量子产率高等优点[84-87].因此在细胞成像、动物成像中已获得广泛应用.

Nie等[88]制备了CyP探针分子来检测内源性ALP活性，已成功实现对细胞、组织和小鼠中ALP活性的分析(LOD为0.003 U/mL)(图4a).Tan等[89]合成了一种基于DHXP的近红外探针，用于灵敏检测体内外碱性磷酸酶的活性(图4b).制备的NIR-DHXP显示出良好的溶解性、高反应活性、高细胞渗透性和显著的近红外发射，并且具有良好的生物相容性和快速细胞内化能力的优点，有望成为生物医学研究的有用工具.此外，Gao等[90]开发了一种由七甲川花菁荧光团和一个磷酸单酯构成的近红外探针(QcyP)，用于特异性检测不同细胞系和荷瘤小鼠模型中的ALP水平(图4c).该探针对ALP显示出了很高的选择性和灵敏度.更重要的是，该探针不仅可以区分不同细胞系中ALP的水平，而且可以区分肝肿瘤模型小鼠和正常小鼠ALP水平的变化.2019年，Lin课题组[91]开发了一种开启式分子探针(LET-3)，通过近红外荧光(NIRF)和光声(PA)双模成像观察肿瘤组织中ALP的活性(图4d).LET-3由近红外半菁染料(LET-CyOH)和无磷酸部分组成，经ALP活化后，在730 nm处NIRF增强23倍，在710 nm处PA增强27倍.体内外诊断实验表明LET-3对ALP具有较高的敏感性和选择性.这些发现为使用NIRF和PA双通道开启探针在体内检测ALP提供了一种很有前景的策略.

图4 CyP(a)、DHXP(b)、QcyP(c)和LET-3(d)体内内源性ALP检测示意Fig.4 Schematic diagram of CyP (a), DHXP (b), QcyP (c) and LET-3 (d) in detecting endogenous ALP in vivo

此外，Meng等[92]开发了第1个缺氧触发和NTR酶响应单分子探针，用于高对比度NIR Ⅱ/PA肿瘤成像和缺氧激活的光热疗法(图 5a).该探针利用了基于荧光体上的硝基直接还原为氨的反应机理.IR1048-MZ分子探针本身具有非常弱的NIR Ⅱ和PA信号.然而，在缺氧肿瘤激活后，探针发出强烈的NIR Ⅱ荧光和PA信号，该信号提供了更准确和更深的组织成像的肿瘤的位置和边界.重要的是，IR1048-MZ的缺氧激活的光热疗法表现出卓越的光疗功效，随着温度的快速增加，导致肿瘤消融，没有复发.2019年，Miao等[93]构建了一种基于氰基结构的频率上转换NTR探针(Cy7-NO2)用于识别体内NTR活性(图5b).该探针在850 nm处激发，在790 nm处发射.与其他检测方法相比，探针的激发和发射区域在NIR区域中，可以增强组织穿透深度.此外，该探针可以通过较低的噪声背景信号和更高的信噪比来增强体内检测能力和成像质量.因此，Cy7-NO2预期是一种方便而有效的上转换探针，以区分体内缺氧肿瘤.

图5 IR1048-MZ(a)和Cy7-NO2(b)体内内源性NTR检测示意Fig.5 Schematic diagram of IR1048-MZ (a) and Cy7-NO2 (b) in detecting endogenous NTR in vivo

4 结论

荧光探针作为一种新兴的肿瘤检测、定性和手术指导的方法，它的高时空分辨率和非放射性的优点尤其引人注目.利用亚微米尺度的空间分辨率，荧光成像实际上可以在单细胞分辨率下研究病理学，这对于早期肿瘤检测和肿瘤手术是非常理想的.本文主要通过对具有安全性高、生物相容性好、光学稳定性强等优点的有机小分子染料在不同肿瘤标志物中的检测进行总结，并通过其荧光信号强度实现生物体内酶活性的检测，以期达到对早期肿瘤的实时检测.用于肿瘤成像的荧光探针的研制越来越引起人们的研究兴趣，随着新技术的不断发展和新设备的不断涌现，荧光成像的研究范围将不断扩大，有望为人类疾病诊断和治疗提供一种崭新的方法.