咀嚼力增强对骨质疏松大鼠颌骨骨丢失的保护作用及机制*

马宗民，李淑娴

(大连大学机械工程学院，大连 116622)

1 引 言

骨质疏松症可致颌骨骨质丢失，引起颌骨骨质疏松[1]。颌骨骨质疏松可引起牙齿松动、脱落；影响种植体愈合；破坏咀嚼系统的功能协调，增加颞下颌关节疾病发生的机率；甚至引起消化系统功能障碍等疾病，严重影响人们的身心健康和生活质量[2-4]。因此，颌骨骨质疏松的防治引起很多学者的关注。有学者进行了药物防治的研究[1，4]，但药物治疗副作用大，且价格昂贵。

骨组织具有力学适应性，生物力学因素是保持骨量的关键因素[5]。生物力学疗法具有非药物性、非侵入性、费用低等优点。颌骨承载的载荷主要来自咀嚼运动产生的咀嚼力。咀嚼运动是人类的正常生理活动。因此，采用咀嚼力主动增强防治颌骨骨丢失易于实现，且成本低。

咀嚼运动对颌骨的生长发育、外观、微观结构等有重要影响。Mavropoulos等[6]研究了咀嚼对成年大鼠牙槽骨微观结构的影响。Alexander等[7]研究了咀嚼载荷对小鼠下颌骨的影响，认为食物影响下颌骨形状的微观进化。Hassan等[8]进行了多代软性饮食对小鼠颅面形态的影响。Campos等[9]研究了不同咀嚼方式牙槽骨的横向尺寸的影响。Watson等[10]认为咀嚼功能和松质骨形态之间存在紧密的联系。Bozzini等[11]认为咀嚼负荷减小会降低生长期大鼠下颌骨的力学性能。

当前研究多集中在正常硬度饲料或软性饲料喂养对颌骨的影响，喂食高硬度饲料增强咀嚼功能对骨质疏松颌骨影响的研究尚不多见。因此，本研究拟采用高硬度饲料喂食去卵巢骨质疏松大鼠，观测牙槽骨微观结构及TGF-β、OPG、RANKL等表达的变化，探索主动增强咀嚼功能对颌骨骨丢失的保护作用及机制。

2 材料和方法

2.1 实验动物

清洁级健康雌性SD大鼠，牙列完好，3月龄，体重250～300 g，购自大连医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2008—0002。两种硬度饲料，正常硬度(硬度123 N)饲料和高硬度(硬度216 N)饲料，均定制于江苏省协同医药生物工程有限责任公司，营养成分一致，符合GB14924.3-2010的规定。实验过程中对动物的处置符合国家科技部、卫生部《实验动物管理条例》相关动物伦理学标准的条例。

2.2 试剂与仪器

ELISA试剂盒(上海酶联公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；TIANScript RT KIT试剂盒(北京天根公司)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(北京天根公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；低温冰箱(日本SANYO公司)；显微CT机(德国Siemens公司)；酶标分析仪(RT-6100，深圳雷杜公司)；微量加样器(法国Gilson公司)；生物分光光度计(德国Eppendorf公司)；荧光定量PCR仪(上海宏石医疗)等。

2.3 实验方法

2.3.1分组与处理 30只大鼠，正常饲料适应性喂养1周开始试验，20只采取背部入路方式摘除卵巢，10只切除等量小块脂肪，但不摘除卵巢(假手术组)，术后全部正常饲料喂食。2个月后，摘除卵巢大鼠随机分为模型组和实验组。假手术组和模型组大鼠继续正常硬度饲料(硬度123 N)喂食，实验组大鼠喂食高硬度饲料(硬度216 N)，分组喂食2个月后处死。

2.3.2取材 大鼠断食、不断水12～24 h后处死。

血清样本：大鼠腹腔注射水合氯醛，腹主动脉取血，室温静止30 min以上，3 000转/min、15 min离心取上清，分装后于-80℃保存，备用。

颌骨样本：取两侧上颌骨，去除软组织，一侧上颌骨置入10%福尔马林溶液固定，另一侧上颌骨放入-80℃冰箱保存， 备用。

2.3.3血清生化指标检测 血清雌二醇(E2)、骨钙素(BGP)和碱性磷酸酶(ALP)采用ELISA试剂盒检测。

2.3.4显微CT检测 利用显微CT对大鼠上颌骨进行扫描，扫描参数为：电压 80 kV、电流450 μA、分辨率15.48 μm，检测第二磨牙区牙槽骨骨体积分数( BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)等骨形态计量学指标。

2.3.5TGF-β、OPG和RANKL基因表达检测 采用实时定量RT-PCR方法对上颌骨第二磨牙区牙槽骨中的TGF-β、OPG、RANKL的mRNA进行表达测定。首先取骨组织样品，利用Trizol 试剂提取组织中总RNA；应用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；采用TIANScript RT KIT试剂盒进行逆转录；应用SuperReal PreMix Plus试剂盒进行定量扩增；实时检测循环阈值(Ct，cycle threshold)；模型组作为对照，采用比较CT法进行相对定量分析。引物信息见表1。

表1 引物序列

2.4 统计学分析

实验数据采用均值±标准差表示，应用SPSS 18.0统计软件进行分析，采用独立变量t检验。设定P<0.05为差异显著。

3 结果

3.1 大鼠血清生化指标

图1和表2为大鼠血清生化指标检测结果。由此可知，模型组和实验组大鼠血清雌激素E2较假手术组显著下降(P<0.05)，表明去势手术成功；模型组和实验组大鼠血清骨钙素BGP和碱性磷酸酶ALP较假手术组显著上升(P<0.05)。与模型组大鼠相比，实验组大鼠血清雌激素E2上升，骨钙素BGP和碱性磷酸酶ALP下降，但不显著。

表2 大鼠生化指标检测结果

注：*与假手术组比较，*P<0.05。

3.2 骨形态计量学指标

图2和表3是大鼠上颌骨第二磨牙区牙槽骨骨形态计量学指标检测结果。与假手术组相比，模型组和实验组的骨体积分数、骨小梁宽度和骨小梁数量下降，骨小梁分离度升高，差异有显著性(P<0.05)；实验组与模型组相比，骨体积分数升高，差异显著(P<0.05)，骨小梁宽度升高、骨小梁数量升高、骨小梁分离度降低但不显著。骨的微观结构有改善趋势。

表3 大鼠上颌骨显微CT检测结果

3.3 TGF-β、OPG和RANKL基因

图3和表4是大鼠上颌骨第二磨牙区牙槽骨TGF-β、OPG和RANKL基因表达检测结果。与假手术组相比，模型组TGF-β、OPG下降，RANKL升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，实验组TGF-β、OPG升高，RANKL下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 大鼠上颌骨TGF-β/OPG/RANKL基因检测结果

注：*P<0.05(与假手术组比较)，#P<0.05(与模型组比较)。

注：*P<0.05(与假手术组比较)，#P<0.05(与模型组比较)

4 讨论

颌骨骨质丢失是全身骨质丢失在口腔的局部表现，并导致的口腔严重问题[12]。雌激素水平下降可致颌骨骨质丢失，摘除卵巢建立的骨质疏松模型常用于颌骨骨质丢失的研究[1，13]。本研究采用去势的方法建立颌骨骨质疏松动物模型。本研究发现去势4 个月后，模型组与实验组及假手术组相比，雌激素E2水平显著下降(P<0.05)，表明摘除卵巢手术成功；模型组微观结构退化，与假手术组存在显著差异，发生骨质疏松。

与模型组相比，实验组雌激素E2有升高，但不显著。有研究表明，适当强度的运动可以增加血清雌激素E2水平[14]。本研究结果趋势与之基本一致，但结果差异并不显著，分析原因可能是咀嚼运动只是局部身体器官运动所致。血清骨钙素BGP、碱性磷酸酶ALP主要由成骨细胞分泌合成，是骨转换和骨形成的特异性指标[15-16]。从本研究结果看，模型组和实验组与假手术组相比，骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)水平显著升高，说明大鼠去势后，骨重建处于活跃状态，骨转换率高；与模型组相比，实验组骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)有降低，但不显著，表明咀嚼力增强可在一定程度上抑制骨重建的活跃状态和骨吸收，但未达到正常水平，这与文献[16]、[17]基本一致。表明咀嚼力增强可能通过调节血清雌激素(E2)、骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)水平调控骨重建活跃度及平衡方向，改善骨质疏松情况。

适宜的力学刺激能够促进骨生长。颌骨是重要的咀嚼器官，承载咀嚼负荷，颌是全身骨代谢最活跃的器官。本研究结果显示，喂食高硬度饲料干预2个月后，实验组与模型组相比，骨体积分数显著升高；骨小梁宽度、骨小梁数量上升，骨小梁分离度降低，但不显著。Mavropoulos等[18]认为正常咀嚼功能的咀嚼力能够延缓摘卵巢大鼠颌骨微观结构的退化。本研究是在摘除卵巢术后2个月喂食高硬度饲料进行干预，保证术后形成骨质疏松状态，观测咀嚼力增强对骨质疏松干预效果。验证了增强咀嚼力基本能够延缓骨质疏松的进展。

TGF-β对骨重建有重要调节作用，在骨形成与骨吸收耦合平衡方面起着关键作用[19]。有研究显示，力学刺激能够促进TGF-β在骨组织中的表达[20]。本研究实验组大鼠牙槽骨的TGF-β表达显著高于模型组，这表明增强的咀嚼力能够促进牙槽骨中TGF-β的表达，与之前研究结论基本一致[20]。

OPG/RANKL/RANK信号通路是调节骨重建的重要信号通路[21]。OPG与RANKL的比值对体内破骨细胞的形成和成熟起着决定作用，平衡倾向于OPG时，活性破骨细胞减少，平衡倾向于RANKL时，活性破骨细胞增加，从而影响骨平衡的方向。有研究表明，摘除卵巢骨质疏松后，大鼠OPG表达下降，RANKL表达上升[22]。本研究模型组与假手术组相比，OPG表达显著下降，RANKL表达显著上升。力学刺激对OPG/RANKL/RANK信号通路有调节作用[23]。本研究实验组与模型组相比，OPG显著升高，RANKL显著降低，表明增强咀嚼载荷能够调节OPG/RANKL/RANK信号通路。

5 结论

本研究采用高硬度饲料喂食去卵巢骨质疏松大鼠，观测牙槽骨微观结构及TGF-β、OPG、RANKL等表达的变化，探索主动增强咀嚼功能对颌骨骨丢失的保护作用及机制。研究发现增强咀嚼力对骨质疏松大鼠颌骨骨质丢失有一定的保护作用，对骨重建信号通道TGF-β与OPG、RANKL有一定的调节作用；增强咀嚼力会在一定程度上影响血清雌激素(E2)、骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)等生化因子的表达。

口腔环境非常复杂，牙槽骨重建还受到牙周炎等牙周病的影响，骨内有多种信号调节通道。因此，增强咀嚼力进行颌骨骨质丢失的保护如何达到最好效果还需进一步研究。