利用荧光共振能量转移技术检测基质刚度对细胞外调节蛋白激酶信号的调控*

周颖，邓林红，欧阳明星，徐华栋

(常州大学药学院&医学院(筹)，生物医学工程与健康科学研究院，常州 213164)

1 引 言

生物体内的细胞处在一种复杂的力学微环境中。在胚胎发育并分化成不同组织的过程中，细胞周围的基质刚度会发生变化，例如脑组织的刚度为103Pa，而骨组织的刚度达107Pa[1]。当组织发生病变时，其细胞的刚度及周围基质刚度也随之变化，例如，癌变的细胞相比普通细胞会更软一些[2]，而由于细胞增殖和基质沉淀，癌变处的局部组织会变得较硬[3]；肝脏病变时出现肝硬化的现象[4]；体内胆固醇水平升高时，红细胞硬化的程度也会随之增加[5]。

细胞周围基质刚度的变化同样也会影响细胞生化信号和细胞迁移、生长、分化等生理活性[6-9]。在针对癌细胞的研究中，发现通过提高细胞周围基质刚度可以诱导细胞膜上整合素表达升高，从而促进癌细胞的转移[10]。有研究表明，将干细胞培养于不同基质刚度上，其分化成不同的细胞，且分化的细胞与基质刚度接近，如当基质刚度接近于体神经组织(<1 kPa)时，干细胞向神经细胞分化；当基质刚度接近于肌肉组织刚度(8～17 kPa)时，干细胞向肌肉细胞分化；在给予较硬的基质(25～100 kPa)时，干细胞则向成骨细胞分化[11]。力学微环境的改变还能调节骨髓间充质干细胞，较软的基质可以促使骨髓间充质干细胞向脂肪、软骨细胞分化，较硬的基质则使其向肌肉细胞分化[12]。在这些研究中，生物力学因素起了关键的作用。

基质刚度的改变会导致细胞内部一些信号的激活。细胞外蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)是促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成员，其信号传递途径涉及调节细胞生长、分化、发育等信号网络，与细胞增殖息息相关[13-14]。研究表明ERK信号调节哮喘条件下的气道炎症反应和平滑肌增生[15-17]。有研究报道环境刚度的变化也影响细胞中的ERK信号，刚度增加会上调ERK活性[18-20]，而其力-化学偶联机制仍有待探索。

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是指两个不同的荧光基团距离足够近(接近纳米级别)并且供体荧光基团的发射光谱与受体荧光基团的激发光谱有一定重叠的条件下，激发供体基团时会发生能量转移到受体基团的现象[21-22]。本研究利用FRET技术，通过ERKFRET探针实时观察并十分灵敏地记录大鼠气道平滑肌中ERK活性的变化[23]，探究基质刚度的力学微环境对细胞内部信号的影响。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1细胞种类与来源 大鼠气道平滑肌(ASM细胞)来源于6～8周的雌性Sprague Dawley大鼠，采用机械分散法与酶消化分离取得原代细胞，通过反复贴壁法提纯ASM细胞，免疫荧光法结合相差显微镜的形态学观察法进行鉴定[24]。

2.1.2主要试剂和仪器 DMEM低糖培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶、细胞贴壁消化试剂Accutase细胞消化液、转染试剂盒Lipofectamine 3000、血小板生长因子均购自美国Thermo Fisher Scientific；纤连蛋白购自Corning；ERK抑制剂PD98059购自MCE；3—氨丙基三甲氧基硅烷、戊二醛购自阿拉丁；丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N',N'—四甲基二乙胺购自塞尔斯；磺基琥珀酰亚胺 6—(4'—叠氮基—2'—硝基苯氨基)己酸酯购自Abcam；激光共聚焦培养皿(14 mm)购自NEST公司；FRET显微镜平台和倒置显微镜Primo Vert 购自德国Zeiss公司。

2.2 方法

2.2.1ERK探针和Paxillin-dsRed的质粒DNA扩增 将质粒转化进入感受态菌DH5α中，菌液涂在含氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体琼脂平板上，置于37℃恒温箱中培养。待菌落长出后，挑出单克隆菌落置于含100 μg/mL Amp的LB液体中，于37℃摇菌扩增。使用中提试剂盒(德国QIAGEN)提取和纯化质粒，用NanoDrop(瑞士TECAN)测定DNA浓度后，质粒可用于细胞转染实验。

2.2.2不同刚度聚丙烯酰胺凝胶的制备 在共聚焦皿中制备不同刚度聚丙烯酰胺凝胶的主要步骤如下[25-26]：

(1)共聚焦皿活化加入1 mL 0.1M NaOH溶液，放置5 min后吸除并风干；在皿中的玻璃底上加入200 μL 3—氨丙基三甲氧基硅烷，静置4～5 min后吸除，用三蒸水清洗3次；然后加入400 μL 0.5%戊二醛，避光放置30 min后吸除，用三蒸水清洗3次并倒扣过夜晾干。

(2)聚丙烯酰胺凝胶制备根据下表的成份比例配置不同刚度的凝胶溶液(见表1)，即形成的凝胶杨氏模量(Young＇s modulus)分别为2.5、9.0、21.5 kPa，然后分别加入3 μL 10%过硫酸铵(APS)和2 μL(四甲基乙二胺TEMED)，立刻在每个皿中的玻璃上加入2.9 μL凝胶溶液，覆盖上用乙醇洗干净的盖玻片(14 mm)，室温下避光放置30～60 min。移除盖玻片，三蒸水清洗后，加入PBS溶液，可在4℃冰箱短暂保持。

表1 不同刚度凝胶溶液的配置比例

(3)结合细胞外基质制备好的聚丙烯酰胺凝胶上覆盖150 μL Sulfo-SANPAH活化溶液(0.2 mg/mL)，在紫外灯下(相距小于20 cm)照射10～20 min，更换Sulfo-SANPAH溶液后重复一次，然后用PBS缓冲液洗涤3次，再加入150 μL 纤维连接蛋白 (Fn, 100 μg/mL)溶液，于37 ℃孵育4 h。PBS洗涤1次，加入PBS后存放于4 ℃，使用前不超过2个星期。

(4)种植细胞凝胶样本在紫外灯下消毒10 min，吸掉PBS后加入0.5 mL DMEM培养基(1% FBS，无抗生素)，在细胞培养箱中平衡10 min，然后加入含细胞的培养液，细胞贴壁后的密度达60%左右。

2.2.3ASM细胞培养并转染FRET探针 ASM细胞培养在含10% FBS的DMEM低糖培养基中，放置于含5% CO2、饱和湿度的37℃恒温培养箱里，实验中使用的细胞一般传代不超过10次。根据Lipofectamine 3000脂质体转染方法，转染前一天将细胞接种在六孔板中，转染时细胞密度约60%～80%，每个孔转染2.5 μg ERK FRET质粒DNA；8～12 h后用1×PBS清洗细胞一次，更换成新鲜培养基；转染开始24 h后，用Accutase消化液消化细胞，将细胞转移到结合有Fibronectin的凝胶或玻璃上(共聚焦皿里)，并换成含1% FBS的DMEM低糖培养基；24 h后开始显微镜活细胞成像。

2.2.4FRET显微镜成像 在FRET显微镜成像系统中，ECFP成像通道的荧光滤片参数为激发(436±10) nm，分光455 nm，发射(480±20) nm；FRET成像通道的荧光滤片参数为激发(436±10) nm，分光455 nm，发射(535±15) nm。FRET成像时，通过Zeiss软件系统控制ECFP和FRET成像通道的快速切换，确保同时采集两个通道的图像数据。实验拍摄过程中，在10～12 min时，通过外接导管给细胞样品注射加入1 mL含PDGF(终浓度50 ng/mL)的DMEM低糖培养基(1% FBS)。

2.2.5FRET图像数据的定量和统计分析 通过MATLAB软件平台开发的FRET图像分析软件Fluocell6.0.0(Lu S et al.，美国)来进行数据定量分析[27]，实验数据以“平均值±方差”表示。采用统计分析软件Origin8.0和GraphPad Prism6.0进行分析，采用t检验分析数据之间的差异，P<0.05表示具有显著性差异。

3 结果

3.1 基质刚度调节ERK信号激活

转染ERK FRET质粒的大鼠气道平滑肌(ASM)细胞种植在不同刚度的凝胶(2.5、9.0、21.5 kPa)及玻璃上(都包被有100 μg/mL fibronectin)，培养在含1% FBS的DMEM低糖培养基中24 h以上，以降低血清的影响。FRET显微镜延时成像记录不同刚度凝胶上的ASM细胞在PDGF(50 ng/mL)刺激前后的ERK FRET探针信号。通过FluoCell软件分析得到代表荧光比值(FRET/ECFP)的细胞彩图，颜色从蓝到红显示ERK激酶活性从低到高的分布或变化。PDGF刺激有效地激活了培养在凝胶和玻璃上的ASM细胞中ERK活性，而且细胞群体的ERK活性具有不均一性，见图1(a)。FRET定量分析曲线显示，同一组细胞在PDGF刺激后，ERK活性几乎同步地发生不同程度的升高，(培养在2.5、9.0、21.5 kPa凝胶及玻璃上的细胞统计数分别为n=27、20、35、29)见图1(b)。通过比较各组细胞中FRET比值的平均曲线趋势(平均值±方差)，细胞培养在硬玻璃上时比在软凝胶上具有更高的ERK活性，而细胞中ERK活性在2.5 kPa凝胶上又低于在9.0 kPa和21.5 kPa凝胶上，见图1(c)。进一步统计分析证实PDGF刺激前和刺激后，细胞中ERK活性在2.5 kPa凝胶上都保持最低，而在玻璃上保持最高，具有统计上的显著性差异，见图1(d)，这些结果显示ASM细胞中的ERK活性与基底刚度有正相关性。小分子化合物PD98059通过结合ERK上游信号激酶MEK(未激活状态)而抑制ERK的活性[28]，为了证实所观察的FRET信号代表了细胞中ERK的相对活性，我们转染ERK FRET探针的两组细胞培养在9.0 kPa凝胶上，加入PDGF(50 ng/mL)16 min后，其中一组加入ERK抑制剂PD98059(10 μM)。根据FRET比值随时间变化的曲线(平均值±方差)，加PD98059细胞组及对照组的细胞数分别为n=39、45。发现PDGF刺激后一段时间再加入抑制剂PD98059，FRET比值曲线立即出现了快速下降，见图1(e)，表明FRET变化反映了ERK活性。

注：(a)PDGF激活ASM细胞中的ERK活性。(b)来源于(a)的同一组细胞在PDGF刺激(0 min时)前后的ERK FRET比值定量分析。(c)对(b)中的各细胞群体曲线进行平均值统计分析(平均值±方差)。(d)分别取-8 min和10 min两个时间点作t检验分析比较(平均值±标准差)，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。(e)ERK FRET探针验证。

3.2 基质刚度调节ERK信号的上游机制探索

我们初步研究了Src信号通路和细胞内部的收缩力是否参与调控基质刚度对ERK活性的影响。PP1是常用的Src激酶抑制剂，Blebbistatin和Y27632分别抑制肌球蛋白II(Myosin II)ATP水解酶和ROCK信号通路，从而抑制了细胞内部的收缩力反应。转染ERK FRET探针的细胞培养在2.5、9.0、21.5 kPa三种刚度的聚丙烯酰胺凝胶上，实验时细胞和抑制剂提前孵育1 h，浓度分别为PP1(10 μM)、Blebbistatin(25 μM)、Y27632(20 μM)、PD98059(10 μM)。

根据每组细胞反应的FRET平均值曲线，在添加DMSO溶剂(0.1%体积比)的参照实验中，ERK 活性仍然呈现了与凝胶刚度参数的正相关性，见图2(a)；在分别添加PP1、Blebbistanin、Y27632抑制剂的实验中，总体趋势上ERK激酶在2.5 kPa凝胶上的活性(红色曲线)仍低于在9.0 kPa和21.5 kPa凝胶上的活性，同时PDGF都能有效激活ERK，见图2(b)-(d)。添加ERK抑制剂PD98059后，ERK在不同刚度凝胶上的活性差距减小，其本底活性水平受到抑制，但该实验条件下未有效抑制PDGF刺激对ERK的激活，见图2(e)。通过数值统计和t检验分析，比较各组细胞在PDGF刺激前8 min和刺激后10 min的FRET比值分布，结果仍显示ERK活性在不同凝胶刚度上的差异受PP1、Blebbistatin、Y27632三个抑制剂的影响较小，受PD98058抑制剂的影响很显著，见图3。这些结果初步显示基质刚度对细胞ERK活性的调控受Src信号和胞内收缩力的影响较小。

注：不同抑制剂作用下，细胞组中ERK探针的FRET/ECFP比值随时间变化的平均值曲线(平均值±方差)，培养在2.5、9.0、21.5 kPa凝胶上的细胞统计数分别为(a)：n=48、113、72；(b)：n=144、66、133；(c)：n=46、102、67；(d)：n=62、144、69；(e)：n=65、93、86。

3.3 基质刚度对黏着斑形态的影响

细胞主要通过黏着斑(focal adhesions)锚定在基质上，粘着斑也是细胞对基质刚度的一个主要感受器[29-30]。Paxillin是一种定位于黏着斑的细胞骨架蛋白，参与调控细胞的黏附和迁移[31]。通过在细胞中表达荧光标记的Paxillin-dsRed[32]，我们初步探索了基质刚度对黏着斑形态的影响。ASM细胞转染Paxillin-dsRed质粒后，转移到2.5、9.0、21.5 kPa三种凝胶及玻璃上，在含1% FBS培养基中培养24 h后，显微镜下拍摄细胞荧光图像。Paxillin-dsRed定位于黏着斑中，将显示黏着斑的细胞切割出来后，观察不同基质刚度上黏着斑的形态差异。当细胞培养在玻璃上时，黏着斑主要呈典型的斑点状和短直线状，而培养在软的凝胶上时，许多细胞中的黏着斑呈不规则的形状或弯曲的线条状，见图4。根据黏着斑形态粗略计算每组条件下的细胞比率，黏着斑形态不规则的细胞在玻璃上占比8.8%(55个细胞中的5个)，21.5 kPa凝胶上占比37.3%(59个细胞中的22个)，9.0 kPa凝胶上占比58.8%(51个细胞中的33个)，2.5 kPa凝胶上占比76.3%(38个细胞中的29个)。该实验结果初步提示细胞可能为了适应不同的基质刚度而调节黏着斑的形态，或黏着斑的变化是基质刚度调控细胞生化活性的一种途径。同时我们注意到，对不同基质刚度上的细胞黏着斑形态变化仍需要有更加定性、定量方面的分析。

注：(a，b)各组细胞中分别选取加PDGF前(-8 min)后(10 min)两个时间点进行统计学分析(平均值±标准差)和t检验比较。

图4 基质刚度对细胞黏着斑形态的影响

4 讨论

细胞的环境刚度变化不仅存在于发育过程，也常见于临床的病理情况下，如肝硬化、血管硬化、肺纤维化、癌细胞肿块等[1,33-36]。物理因素如何参与调节细胞的活动，是近年来快速发展的研究领域。本研究利用FRET技术实时观测细胞中ERK激酶活性，试图研究基质刚度的物理环境因素对细胞中生化活动的影响。此前的一项工作利用FRET技术证明基质刚度调节干细胞中钙信号震荡的频率和幅度，该过程受肌球蛋白活性(Actin filaments/Myosin II)的调控作用不明显[26]。利用ERK FRET检测技术，证实ERK活性与基质刚度有正相关性，其在硬玻璃上的活性高于在软的凝胶上，而在2.5 kPa凝胶上的活性又低于在9.0 kPa和21.5 kPa凝胶上。细胞内的收缩力信号如Myosin活性以及Src信号对基质刚度调控ERK活性的影响不明显，提示在该力-化学信号偶联过程中存在其它的作用途径。

考虑细胞通过黏着斑与基质接触，通过进一步检测发现，在软凝胶上，细胞黏着斑形态变得不规则，初步计算其不规则比率与基质刚度呈一定的正相关性，提示黏着斑介导的细胞黏附力改变可能是调控该力-化学信号偶联过程的一种途径。黏着斑是细胞感受基质环境的一种效应器，根据结果推测细胞通过黏着斑形态的改变以适应不同的基质刚度，而黏着斑形态如何进一步影响细胞的黏附力及下游的生化活动，有待后续研究。