逍遥丸对利培酮所致雌鼠高泌乳素血症抑制作用的机制研究*

王雪龙 李艳嫣 孟 昆

利培酮二代抗精神病药物[1]，临床使用过程中可以引起高泌乳素血症(Hyperprolactinemia，HPRL)这一不良反应[2]，使患者血清中泌乳素(Prolactin，PRL)的含量在40 ng/ml以上[3]。PRL的持续增高会导致下丘脑-垂体-性腺轴功能失调，临床表现为月经不调、不孕不育、乳腺增生、骨质疏松等，大大降低了患者的生活质量[4，5]。临床上，溴隐亭和阿立哌唑可以对抗利培酮引起的HPRL，但同时会带来新的不良反应[6，7]。逍遥丸具有养血调经、疏肝健脾的功效，可以有效改善月经不调、胸胁胀痛等症状。近期有临床研究提示逍遥丸可以有效缓解利培酮所致女性精神分裂症患者HPRL[8，9]，但是其作用机制并不清楚。本研究从表型出发，观察了逍遥丸对利培酮所致HPRL 雌性大鼠的血清PRL 水平影响以及垂体中PRL mRNA 和PRL蛋白表达量的影响，为逍遥丸在抗精神病药物导致HPRL的治疗中提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象 SPF级别SD雌性未孕大鼠购于湖北医药学院实验动物中心，许可证(SYXK(鄂)2016-0031)，体质量193.3～210.6 g。小鼠5只一笼饲养，室温控制在20～25 ℃，保持12 h昼夜交替，适应环境7 d后用于实验。所有动物实验均按照卫生部关于实验动物的饲养和护理的国家指南进行，并经湖北医药学院机构动物护理和使用委员会审查并批准后，根据机构规定进行实验。

1.2 方法

1.2.1 实验药物与试剂 逍遥丸(批号：国药准字Z41021831)，利培酮片(批号: 国药准字H20010309)，甲磺酸溴隐亭片(批号：H20160030)，Prolactin ELISA试剂盒(货号：KE00172)，Prolactin/PRL 特异性抗体 (货号：ab103617)；SYBR Green qPCR Master Mix(货号：04913850001)。

1.2.2 主要仪器 荧光定量PCR仪购于美国ABI公司；免疫印迹相关产品(电泳槽、转膜仪等)购于美国BioRad公司；Epoch全波长酶标仪购于美国BioTek公司；电子天平购于瑞士的梅特勒-托利多公司。

1.2.3 HPRL大鼠模型建立[10]本研究利培酮诱导产生HPRL大鼠，将利培酮按照0.1 mg/kg的剂量每天进行口腔灌胃SD大鼠，对照组给与相同体积的生理盐水。连续 30 d后，如观察到大鼠血清中PRL含量大于对照组两倍，则表明建模成功。

1.2.4 分组与给药 正常大鼠作为对照组，HPRL大鼠随机分为模型组和逍遥丸高、中、低剂量组，每组5只，在实验过程中，HPRL大鼠按照0.1 mg/kg的剂量每天进行口腔灌胃，对照组给与相同体积的生理盐水。根据《药理实验方法学》[11]对小鼠体表面积进行换算进行逍遥丸药物干预，其中正常计量(中剂量)为582.8 mg/kg，高剂量为874.2 mg/kg，低剂量为291.4 mg/kg，连续给药30 d。阳性对照组溴隐亭30 微克/只，溶解至生理盐水进行灌胃。

1.2.5 相关指标的检测

1.2.5.1 血清中PRL含量的测定 大鼠末次给药2 h后，麻醉后进行眼球取血，全血4 ℃静置30 min后，1 000 g/min于 4 ℃离心10 min，分离得到血清，通过ELISA 测定血清中PRL的含量。

1.2.5.2 大鼠垂体中PRL转录水平表达量的变化 大鼠末次给药2 h眼球取血后，将大鼠进行颈椎脱臼处死，于冰盒上迅速取出大鼠的垂体并称重，切取组织的一半加入1 ml Trizol，充分匀浆后，进行总RNA的提取，cDNA的反转录，并通过实时荧光定量PCR检测。β-Actin看家基因作为内参，通过2-ΔΔCt方法来计算组间PRL基因的相对表达量。引物根据GeneBank上的序列设计，由天一辉远公司合成。β-Actin(NM_007393)：正向引物：5’-CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG-3’，反向引物：5’-TGCTGGAAG GTGGACAGTGAGG-3’；PRL(NM_011164)：正向引物：5’-CTGGCTACACCTGAA GACAAGG-3’，反向引物：5’-TCACTCGAGGACTGCAC

CAAAC-3’。

1.2.5.3 大鼠垂体中PRL蛋白水平表达量的变化 大鼠按“1.2.5.2”方式处理，切取垂体组织的一半加入1 ml预冷的生理盐水后充分匀浆，离心(4 ℃，12 000 g，30 min)，取上清液，进行免疫印迹检测(Western Blot)。TubulinA作为内参，比较不同处理组之间PRL的表达量。

2 结果

2.1 逍遥丸对HPRL模型大鼠血清中PRL含量的影响 对照组大鼠血清中PRL浓度为(56.13±8.07)pg/ml，模型组(利培酮诱导组)大鼠血清中PRL浓度为(146.55±13.44)pg/ml，血清PRL含量是对照组的2.61倍，说明造模成功(P<0.01)。在模型组的基础上，进行了逍遥丸的药物干预，结果如下：逍遥丸低剂量组大鼠血清PRL浓度为(138.24±20.71)pg/ml，与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；逍遥丸中、高剂量组PRL血清浓度分别为(119.91±9.11)pg/ml和(87.45±10.81)pg/ml，溴隐亭组血清PRL为(69.19±4.33)pg/ml，三组血清PRL含量均低于模型组 (P<0.05)。见图1。

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；

2.2 逍遥丸对HPRL模型大鼠垂体中PRL转录水平与PRL蛋白表达量的影响 模型组(利培酮诱导组)大鼠垂体中PRL转录水平高于对照组(P<0.01)；将模型组中的表达量标准化为1.0，与之相比，逍遥丸低剂量组大鼠垂体中PRL转录水平差异无统计学意义[(0.983±0.107)倍](P>0.05)，逍遥丸中、高剂量组中PRL转录水平均低于模型组[分别为(0.825±0.081)倍和(0.701±0.040)倍] (P<0.05)。同时，与模型组比较，溴隐亭组大鼠垂体中PRL转录水平为(0.547±0.083)倍。见图2。

2.3 逍遥丸对HPRL模型大鼠垂体中PRL蛋白表达量的影响 从图3免疫印迹实验可知，内参TubulinA在各组之间的表达量基本一致。模型组(利培酮诱导组)大鼠垂体中的PRL蛋白表达量高于对照组(P<0.05)。逍遥丸低剂量组大鼠垂体中PRL蛋白表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；而中、高剂量组中PRL蛋白表达量均低于模型组(P<0.05)。同时溴隐亭组垂体中PRL蛋白表达量低于模型组(P<0.05)。

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与对照组比较，△P<0.01

注：*表示非特异性条带

3 讨论

目前临床上主要依赖于西药治疗利培酮所导致的HPRL，如溴隐亭与利培酮联合使用，阿立哌唑与利培酮联合使用等[12]。这些药物确实可以降低患者血清中的PRL，但这些药物会降低利培酮的疗效，在使用过程中也会带来一些新的不良反应，甚至会加重精神疾病症状。因此，利培酮发挥抗精神分裂症作用的同时，降低其诱导的HPRL，成为精神分裂症治疗中亟待解决的问题。

近年来，许多学者运用中医理论研究抗精神病药物所致HPRL的病因病机，并表明中医药治疗HPRL有效，可以提高西药疗效，且安全性佳[13，14]。龙胆泻肝汤通过调控雌鼠下丘脑和垂体中TGF-β信号通路改善抗精神病药诱导的HPRL[15]；芍药甘草汤能有效治疗利培酮和奥氮平引起的HPRL，降低患者的血清PRL水平，且未见明显药物不良反应[16，17]；麦芽不仅可以有效地治疗利培酮所致男性HPRL[18]，而且麦芽提取物对于利培酮所致HPRL大鼠模型也有着抑制作用[10]；柴胡调和汤能改善抗精神病药物所致HPRL[19]。本研究中的中药制剂逍遥丸出自《太平惠民和剂局方》，由柴胡、当归、白芍、白术、茯苓等组成，具有疏肝解郁功能[20]。最近研究表明，逍遥丸对利培酮所致女性精神分裂症患者HPRL有效，对精神分裂症临床症状无明显影响，无明显不良反应[8，9]。但是临床研究由于样本量小、研究时间较短、患者个体差异较大；另外，逍遥丸的临床效果是否通过降低体内的高PRL，在何种水平上调控并不清楚，所以需要在动物水平进行实验研究。在本次HPRL大鼠模型实验研究中，从血清、转录和蛋白表达水平首次证明了逍遥丸中剂量组以及高剂量组能够有效降低HPRL大鼠血清中PRL含量，且高剂量的效果要比中剂量的更加明显。原因是减少PRL在大鼠垂体mRNA和蛋白质水平的表达，这与逍遥丸的临床治疗效果一致，提示逍遥丸可以通过下调垂体中PRL的表达量，有效改善抗精神病药物所致HPRL。

虽然本研究结果表明逍遥丸可以调控PRL的表达，但逍遥丸调控的机制仍需要进一步研究。(1)逍遥丸/散的分子调控机制未知。前期研究表明，大鼠服用逍遥丸后，脑区的一系列基因的表达水平发生了显著性变化，例如HSPA1A[21]、DUSP14[22]、GABRD[23]、Npas2[24]等；并且调控了ERK/MAPK[25]、JAK/STAT[26]、cAMP/PKA[27]等多条信号通路。遥逍丸降低大鼠垂体PRL的含量是否与这些基因和信号通路之间存在协同或拮抗的分子调控，值得进一步探究。最近一项研究通过代谢组学发现，逍遥丸/散通过调节亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的合成以及二元酸、脂肪酸、精氨酸和脯氨酸的代谢发挥作用[28]，提示未来可以通过转录组、代谢组、蛋白质组等组学手段系统研究逍遥丸/散调控PRL的作用机制。(2)逍遥丸/散调控PRL的活性成分未知。逍遥丸具有比较复杂的生物活性成分和活性靶点。利用高效液相色谱结合LTQ-Orbitrap质谱，Li N等[29]在逍遥丸中鉴定到芍药苷、甘草苷、甘草酸、阿魏酸、柴胡皂苷A和C、姜黄素和茯苓醇八种活性化合物。Zhou Y等[30]使用气相色谱-质谱(GC-MS)方法鉴定了遥逍丸中的4种成分：Z-藁本内酯、棕榈酸、阿特拉辛内酯I和阿特拉辛内酯II。Yuan N等[31]利用美国食品药品监督管理局(FDA)批准的抗抑郁药和cMap数据库，通过网络药理学分析，并通过TCMSP网络服务器对149个药理活性成分进行了分类,并预测了99个抑郁症相关靶点。逍遥丸/散中何种活性成分调控垂体PRL基因的表达，从而调控PRL的含量，需要进一步研究。

本研究利用HPRL大鼠模型来研究逍遥丸对利培酮所致雌鼠HPRL的抑制作用，促进了药物的作用机制研究与现实临床病例研究紧密结合，但对于逍遥丸作用的分子下游信号通路和靶向机制有待于深入研究。利用该模型也可以进一步研究逍遥丸联合其他药物缓解抗精神病药物所致HPRL，从而实现更大的临床现实价值。