氧化苦参碱对特应性皮炎模型小鼠的保护作用

孙 赟陈桂芳高 娟张丽娟张 祎*王睿睿*

(1.云南中医药大学，昆明 650500；2.云南省民族特色养生理论与健康产品工程实验室，昆明 650500)

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种较为常见的慢性皮肤疾病，容易复发，常发病于婴儿和儿童，少见发病于成年人。AD是一种特殊类型的湿疹[1－2]，其主要症状是皮肤瘙痒，伴随不同程度的皮屑脱落和皮肤溃烂，严重者甚至会产生睡眠障碍，具有慢性迁延和反复发作的特征。近年来AD的发病是呈上升的趋势[3]，目前发病机制尚未完全阐明，其病因十分复杂，可能与遗传、免疫、环境、感染、精神心理、皮肤屏障受损等多种因素有关[4]。

中西医治疗AD的方法各有不同[5]。现代医学从基因、免疫、皮肤屏障功能、感染等多种因素进行了深入的研究，在诊断以及流行病学方面取得了一定成绩。对于AD的治疗，常用方法是使用抗组胺药，以及在局部使用润肤剂、皮质类固醇激素和免疫抑制剂等，但使用时间过长会产生副作用，患者耐受程度较低。中医对AD疾病的治疗药物较多，有汤剂，散剂、油膏剂、外洗剂等，包括了口服和外用等剂型，在治疗和减少复发方面均有一定特色和优势[6]。

氧化苦参碱具有广泛的药理作用，如抗病毒、抗炎、抗心律失常、抗纤维化、免疫抑制及抗肿瘤等[7－12]，研究标明，氧化苦参碱可改善小鼠湿疹及慢性湿疹皮损，显著减轻炎症反应[13－16]。本文拟探讨氧化苦参碱治疗AD小鼠模型的药效作用和初步作用机制，为AD治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠，雌雄各半，6~8周龄，体重(20±2)g；SPF级雌性BALB/c小鼠，6~8周龄，体重(20±2)g，均购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]。小鼠饲养于云南中医药大学实验动物中心屏障环境中[SYXK(滇)2017-005]，温度:22℃~24℃，湿度:45%~55%，光照12 h为一个循环。本实验经云南中医药大学实验动物伦理审查委员会审查(R-0620160015)，符合国家实验动物福利相关规定。实验遵循实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

氧化苦参碱，≥98%(HPLC)，上海源叶生物科技有限公司，批号Y30S6Y17043；醋酸地塞米松，浙江仙琚制药股份有限公司，批号170512；右旋糖酐，Biotopped公司，批号17-0270-01；2，4-二硝基氯苯，成都贝斯特试剂有限公司，批号Z0016B5；丙酮，云南杨林工业开发区油滇药业有限公司，批号20160325；橄榄油，山东鲁花集团有限公司，批号20180803；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，天津市光复精细化工研究所，批号50116；IgE ELISA试剂盒，联科生物，批号A27591234；IL-4 ELISA试剂盒，联科生物，批号A20481252；IL-13 ELISA试剂盒，联科生物，批号A21300855。全波长多功能酶标仪，昆明倍捷科技有限公司，型号:Plus384；－80℃超低温冰箱，美国Thermo Forma公司，型号:Forma 902；低温高速离心机，德国Eppendorf公司，型号:5810R；电子分析天平，奥豪斯仪器有限公司，型号:AR224CN。

1.3 实验方法

1.3.1 氧化苦参碱对右旋糖酐致小鼠瘙痒模型的影响

将50只KM小鼠按性别体重随机分为5组，设空白对照组、模型对照组、阳性对照组(醋酸地塞米松1.5 mg/kg)以及氧化苦参碱高、低剂量(100、50 mg/kg)组，每组10只；地塞米松组、氧化苦参碱各剂量组分别灌胃给予相应药物，每日2次，连续7次。空白对照组、模型对照组灌胃等体积的0.5%CMC-Na。末次给药后10 min，在每只小鼠左后足脚垫内注射右旋糖酐50μL，观察并记录15 min内小鼠舔后足的次数，小鼠连续舔后足出现短暂停顿记为1次瘙痒。

1.3.2 氧化苦参碱对AD模型小鼠的影响

60只BALB/c小鼠经适应性饲养1周后，随机分为空白对照组(BC)、模型对照组(DEX)、阳性对照组(醋酸地塞米松2 mg/kg)(OXM)、氧化苦参碱低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg；OXY-L、OXYM、OXY-H)，每组8只。实验前1 d，所有小鼠用电推剪加脱毛膏进行背部脱毛(2 cm×2 cm)，暴露皮肤；实验第1、2天，除空白对照组外，其余小鼠在背部皮肤涂抹以丙酮-橄榄油混合溶液为溶媒配制的3%2，4-二硝基氯苯(DNCB)溶液，每次100μL，第3~6天不作任何处理，第7天开始每隔2 d涂抹1次1%DNCB溶液，每次70μL，共3次。空白对照组小鼠背部皮肤仅涂抹丙酮-橄榄油混合溶液，涂抹时间和体积与造模组一致。自实验第1天开始各组分别灌胃给予相应药物，每天1次，连续给药14 d，每天称重。末次给药前禁食不禁水12 h，末次给药后30 min麻醉，腹主动脉取血，剖取脾和胸腺、称重，计算脏器系数，剪取背部造模处皮损组织切为两部分，一部分置于－80℃冰箱，一部分置于10%中性福尔马林溶液中备用。

分离血清，采用ELISA试剂盒测定血清中总IgE和Th2型细胞因子IL-4、IL-13的含量；10%中性福尔马林固定的皮损组织经脱水、透蜡、包埋、切片等制备成病理切片，HE染色观察一般组织病理学变化；石蜡切片经脱蜡进行甲苯胺蓝(TB)染色以观察皮损组织真皮层中肥大细胞(mast cell，MC)的浸润情况，每组随机选取8个视野，拍照，封片。

1.4 统计学方法

采用Graphpad prism 8.0.2软件对所得数据进行统计学分析，以平均数±标准差(±s)表示，用单因素方差分析和t检验分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化苦参碱对瘙痒模型小鼠的影响

与模型对照组相比，氧化苦参碱高低剂量可减少小鼠的抓痒次数(P<0.01)，对右旋糖酐所致瘙痒有一定程度的抑制，以50 mg/kg效果较佳，因此选择此剂量为受试剂量继续探究氧化苦参碱对特应性皮炎实验的干预效果及初步作用机制(图1)。

图1 对右旋糖酐所致小鼠瘙痒的影响(n＝10)Figure 1 Effect of oxymatrine on itching mice model induced by dextran

2.2 氧化苦参碱对AD模型小鼠的影响

2.2.1 氧化苦参碱对AD小鼠一般情况的影响

与模型对照组相比，阳性对照组小鼠体重偏低，氧化苦参碱各剂量12 d后小鼠体重均呈现上升趋势(图2)。

图2 对AD小鼠体重的影响(n＝8)Figure 2 Effect of oxymatrine on the body weight of AD mice

2.2.2 氧化苦参碱对AD模型小鼠脏器系数的影响

与模型对照组相比，氧化苦参碱高剂量可降低AD模型小鼠的胸腺系数(P<0.01)表现出类似地塞米松样的免疫抑制作用；氧化苦参碱高中剂量可降低小鼠脾系数(P<0.05)，推测可能与抑制被过度激活的B淋巴细胞有关(图3)。

图3 对AD模型小鼠脏器系数的影响(n＝8)Figure 3 Effect of oxymatrine on organ coefficients of AD model mice

2.2.3 氧化苦参碱对血清总IgE含量的影响

与空白对照组相比，模型对照组小鼠外周血总IgE含量增加，差异无统计学意义；与模型对照组比较相比，阳性药和氧化苦参碱高剂量均能显著抑制AD模型小鼠外周血总IgE的表达(P<0.05)(图4)。

图4 对AD小鼠外周血总IgE含量的影响(n＝8)Figure 4 Effect of oxymatrine on the total IgE content of peripheral blood in AD mice

2.2.4 氧化苦参碱对外周血Th2型细胞因子含量的影响

与空白对照组相比，模型对照组小鼠外周血IL-4、IL-13含量均有增加趋势，但无统计学意义；与模型对照组相比，阳性药和氧化苦参碱均能显著抑制AD模型小鼠外周血IL-4、IL-13含量的表达(P<0.05)(图5)。

图5 对小鼠血清Th2型细胞因子的影响(n＝8)Figure 5 Effect of oxymatrine on the content of Th2 type cytokine in AD mice serum

2.2.5 氧化苦参碱对AD模型小鼠皮损组织病理的影响

与空白对照组相比，模型对照组小鼠皮损处皮肤结构严重受损，角化过度，棘层肥厚明显伴灶性海绵水肿，真皮血管扩张充血并伴有大量炎症细胞浸润，毛囊结构减少。与模型对照组相比，阳性对照组小鼠表皮各层结构较清晰，表皮增厚明显减轻，真皮未见血管扩张，炎性细胞较模型组明显减轻，毛囊结构明显增多；氧化苦参碱各剂量组小鼠皮肤炎性细胞浸润减少，角质层角化不全有所缓解(图6)。

图6 对小鼠皮损皮肤一般组织病理的影响(HE染色)Figure 6 Effect of oxymatrine on the general histopathology of skin lesions in mice(HE staining)

2.2.6 氧化苦参碱对AD模型小鼠皮损肥大细胞浸润的影响

与空白对照组相比，模型对照组小鼠皮损处肥大细胞浸润明显增多；与模型对照组相比，地塞米松和氧化苦参碱各剂量均能显著减少皮损处肥大细胞的浸润，具体结果见图7。

图7 对小鼠皮损肥大细胞浸润的影响(TB染色)Figure 7 Effect of oxymatrine on mast cell infiltration in the lesions of AD model mice(TB staining)

3 讨论

AD是慢性易复发的皮肤炎症性疾病，发病机制复杂，其中免疫功能异常是发病的关键环节。细胞免疫中T淋巴细胞在AD中的作用已较为明确，在急性期AD病变主要由Th2细胞和IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子主导，慢性期以Th1型细胞反应为主[17－19]。Th2细胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13可诱导淋巴B细胞产生IgE，间接活化肥大细胞。因此，在AD发病机制中，Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13即是调控AD的关键细胞因子，同时肥大细胞活化后会产生一系列炎症因子，并与T细胞、嗜酸性粒细胞等相互作用，共同参与AD的皮肤瘙痒和炎症反应过程，证明Th细胞、B淋巴细胞及肥大细胞均在AD机制中扮演重要角色。因此，抑制Th2型细胞因子表达，调控肥大细胞应该能够有效抑制AD。

本研究表明，中药苦参中有效成分氧化苦参碱能明显改善小鼠的皮肤病理症状、减轻皮肤增厚，减少肥大细胞的数目以及Th2型细胞因子等在皮肤组织的表达，对AD小鼠有治疗作用，并提示氧化苦参碱治疗AD小鼠的作用机制可能与减少皮肤真皮层中肥大细胞浸润、减轻Th2型细胞因子的表达有关，但氧化苦参碱如何通过下调Th2型细胞因子表达进而减少肥大细胞的募集和激活还有待于进一步的研究。