hACE2-KI/NIFDC小鼠主要生物学特性指标测定

魏 杰王 洪刘甦苏光姣娜周佳琪冯育芳秦 骁王莎莎范昌发付 瑞岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是一种在体内有广泛分布的锌离子依赖蛋白酶。通过负性调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统，在体内广泛参与心脑血管、呼吸系统、泌尿系统、消化系统及肿瘤等生理和病理进程[1－7]。

2018年本单位以C57BL/6为背景鼠，通过将人源化的ACE2基因插入小鼠ACE2基因中构建了hACE2敲入小鼠，命名为hACE2-KI/NIFDC。该小鼠能适用于ACE2相关病理生理研究，并在2019-nCoV疾病研究、疫苗研发中发挥了重要作用[8－10]。

目前，尚没有关于该小鼠主要生物学特性指标的报道。本研究首次通过对不同周龄hACE2-KI/NIFDC小鼠的脏器系数、生理生化的生物学指标的测定，为该模式小鼠提供更广泛的应用基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

4周龄和8周龄雌性hACE2-KI/NIFDC小鼠各10只，SPF级，体重分别为13.5~16.9 g以及18.9~21.9 g，来自本单位模式动物室[SCXK(京)2017-0005]，饲养于IVC屏障环境[SYXK(京)2017-0013]，福利伦理审查由中国食品药品检定研究院福利伦理审查委员会审批(中检动(福)第(B)021号)，实验遵循3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

Sartorius CPA 423电子天平(德国)；光电Mek7222血细胞分析仪(日本)；日立7080全自动生化分析仪(日本)。

生理检测试剂(稀释液DH640，分析清洗液DH520、DH620，溶血剂DH910、DH680)购自上海光电医用电子仪器有限公司；生化检测试剂购自中生北控生物科技股份有限公司，包含丙氨酸氨基转移酶试剂盒(底物法)、天冬氨酸氨基转移酶试剂盒(底物法)、总蛋白试剂盒(双缩脲法)、白蛋白试剂盒(溴甲酚绿法)、碱性磷酸酶试剂盒(NPP底物-AMP缓冲液法)、尿素氮试剂盒(尿素酶-谷氨酸脱氢酶法)、肌酐试剂盒(氧化酶法)、葡萄糖试剂盒(己糖激酶法)、钙(邻甲酚酞络合酮法)、无机磷试剂盒(磷钼酸盐法)、总胆固醇试剂盒(CHOD-PAP法)、总胆红素试剂盒(钒酸盐氧化法)和甘油三酯试剂盒(GPO-PAP法)。

1.3 实验方法

小鼠禁食12 h，先编号称体重，后眼静脉采血术取20μL抗凝血和0.5 mL全血并分离血清，分别用于生理生化指标测定。小鼠处死后解剖脏器称重，通过电子天平对各编号小鼠的心、肝、脾、肺、左右肾、左右肾上腺、左右卵巢进行称重，并计算对应的脏器系数。22项血液生理指标和13项血液生化指标分别通过血细胞分析仪和生化分析仪测定。生理指标包括:白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白浓度(HGB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞红细胞分布宽度(RDW)、白细胞五分类计数、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)和血小板分布宽度(PDW)。生化指标包括:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、钙(CA)、磷(P)、总胆固醇(CHO)、总胆红素(Tbili)和甘油三酯(TG)。

1.4 统计学方法

按照周龄和测定项目分类整理数据，结果以平均数±标准差(±s)表示，并用SPSS软件作独立样本t检验统计分析组间差异。

2 结果

2.1 脏器系数测定结果

11项脏器系数指标中，8周龄组的脾、肺、胸腺、左肾、右肾占体重百分比均低于4周龄组(P<0.01)、心脏占体重百分比高于4周龄组(P<0.01)。肝、左肾上腺、右肾上腺、左卵巢、右卵巢占体重百分比两组间无显著性差异(表1)。

表1 4周龄和8周龄hACE2-KI/NIFDC的脏器系数比较Table 1 Organ coefficient comparison of 4-week-old and 8-week old hACE2-KI/NIFDC mice

2.2 生理指标测定结果

4周龄在MCV、MCH、EOS指标上高于与8周龄组(P<0.05)，在MON%指标上低于8周龄组。其余18项生理指标无显著性差异(表2)。

表2 4周龄和8周龄hACE2-KI/NIFDC血液生理指标的比较Table 2 Blood physiological values comparison of 4-week old and 8-week-old hACE2-KI/NIFDCmice

2.3 生化指标测定结果

4周龄在AST、P两项指标上显著低于8周龄组(P<0.01)，在ALP指标上也低于8周龄组(P<0.05)。其余10项生化指标无显著性差异(表3)。

表3 4周龄和8周龄hACE2-KI/NIFDC血液生化指标的比较Table 3 Serum biochemical values comparison of 4-week-old and 8-week-old hACE2-KI/NIFDC mice

3 讨论

依据《实验动物生物学数据采集技术规范》要求，测定小鼠的主要生物学特性通常选择4周和8周龄小鼠，4周龄小鼠是免疫等常见应用初始周龄，8周龄则代表了成年小鼠的普遍水平。这一规范同样适用于基因工程成小鼠。

hACE2-KI/NIFDC小鼠是学界公认的新型冠状病毒肺炎疾病机理、药物、疫苗的模式动物之一[11－14]。在研究评价中，通常需要测定实验动物的脏体重量、生理生化指标来评价疾病健康状态以及药物疫苗的毒副作用。因此，测定不同周龄小鼠的生物学特性指标能够为其应用建立基础数据。但由于在新冠肺炎疾病研究中，该模型鼠供应紧张，本次生物学数据仅测定了4周龄和8周龄雌性。

脏器系数是反映动物内脏器官状态的生物学指标，在毒性试验和安全评价中经常通过脏器系数的变化来评价相关指标影响因素[15－17]。本研究中，8周龄组的脾、肺、胸腺、左肾、右肾占体重百分比均低于4周龄组(P<0.01)、心脏占体重百分比高于4周龄组(P<0.01)。随着周龄增加，脾、肺、胸腺、左肾、右肾并未出现与体重一致的正相关增长，反映出了不同年龄器官功能的分化成熟状态；只有心脏的脏器系数8周龄组高于4周龄组，反映出随着周龄增长hACE2-KI/NIFDC小鼠的心脏供血能力增强。

血液生理生化指标是反映机体是否正常的两类基础指标。本研究测定的22项血生理指标和13项血生化指标中，仅MCV、MCH、EOS、MON%四项生理指标和AST、ALP、P三项生化指标在4周龄和8周龄雌性组间存在差异，反映了离乳后和性状表达期两个阶段在造血、免疫和肝肾功能的差异MCV、MCH是反映红细胞体积和血红蛋白浓度指标，均存在4周龄高于8周龄的情况，这一结果也符合鼠成年后红细胞体积减小以及血红蛋白运氧功能成熟的情况。EOS是过敏反应指标，4周龄高于8周龄；MON%是细胞免疫指标，8周龄高于4周龄，这两个指标的变化反映出随着周龄增长，细胞免疫不断成熟的状态。其中3项生化指标均存在8周龄组高于4周龄组的情况。AST、ALP是评价肝功能的两项指标，P是评价肾功能的指标。在应用该小鼠进行肝肾功能评价时，需要排除性别和周龄差异带来的影响。较之常规品系，本研究中转基因小鼠不同周龄差异化生理生化指标相对较少，这可能也与基因敲入有关[18]。在疫苗研发的动物实验中，经常选用4~5周的小鼠进行免疫并定期观察。对于雌性的该模型鼠，4周龄和8周龄组18项指标和10项生化指标均没有统计学差异。但对于药物评价通常使用某体重组的小鼠研究来说，没有周龄界定，在评价生物学指标时也需要关注周龄变化可能带来的影响。