白术-白芍药对防治肝纤维化的网络药理学研究

周雅 汪琪 孙庆珠 赵雨哲 张永生

浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053

肝纤维化是酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝癌等疾病的常见病理变化，如不及时治疗，可能会导致肝癌和肝衰竭[1]。目前临床上针对肝纤维化的基本治疗策略是病因治疗联合抗肝纤维化治疗[2]，但迄今为止尚无疗效确切的抗纤维化药物。研究证实，基于辨证的个体化和多样化的中西医结合治疗方案在肝病领域有较好的优势[3]，“肝脾同治”治法被普遍运用，收效卓著。

白术-白芍药对首见于 《神农本草经》，二者合用，一阳一阴，刚柔相济，柔肝安脾，乃调和脾胃之常用配伍。现代研究显示，白术-白芍药对具有保肝抗炎、抗肿瘤、保护肠黏膜等功效[4]。当归芍药散、痛泻要方、逍遥散[5]之经典方剂中皆有该药对，用于治疗肝郁脾虚证者疗效明显。

本文运用网络药理学的方法筛选白术-白芍药对的主要药物成分，预测其防治肝纤维化的作用靶点及信号通路，并分析其可能的作用机制，为肝脾同治理论提供网络药理学依据。

1 材料和方法

1.1 药物成分收集与筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），分别以白术、白芍为关键词搜索其药物成分，然后以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物类药性（drug likeness，DL）≥0.18作为筛选条件[6-7]，筛选出所需成分。

1.2 药物成分中潜在作用靶点和疾病靶点的筛选在TCMSP中分别以“白术”“白芍”为关键词进行搜索，选择“Related Targets”，与符合条件的药物成分匹配得出靶点，并将其导出。将获取的药物成分对应的靶点信息录入 UniProt数据库（https://www.uniprot.org/），选择物种为“Homo sapiens”，最终得出白术-白芍药对潜在作用靶点的标准名称。

分别在人类基因组注释数据库（Human Genome Annotation Database，GeneCards） （https://genealacart.genecards.org/）、人类孟德尔遗传在线（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（https://www.omim.org/）中，以“liver fibrosis ”为关键词进行检索，获取肝纤维化相关的靶点基因，导出结果后去重汇总，获得肝纤维化疾病相关靶点合集。

1.3 活性成分与靶点的网络构建 通过网站Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es），将药物靶点与疾病靶点进行匹配，在线绘制活性成分靶点与疾病靶点的韦恩图，获得白术-白芍药对活性成分治疗肝纤维化的交集靶点。通过韦恩图可以更加直观地看出，该药对可通过多基因靶点治疗肝纤维化。运用Cytoscape 3.7.2软件构建白术-白芍药对活性成分和靶点的可视化网络图，直观展现出成分与靶点之间的关系，并进一步分析白术-白芍药对配伍治疗肝纤维化的作用特点。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建与分析 将交集靶点上传至String数据库（https://string-db.org/），物种选为“Homo sapiens”，评分条件设定为0.7，利用Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI网络图。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）功能和（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 通路富集分析 将关键靶点导入人类基因组注释数据库Metoscape（http://metascape.org//），进行GO功能富集分析，包括分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）及细胞组分（cellular component，CC）三个方面；并进行KEGG通路富集分析，设定阈值P＜0.05，筛选部分结果。

2 结果

2.1 白术-白芍药对的活性成分 基于OB≥30%和DL≥0.18两个并列条件，通过 TCMSP数据库对白术-白芍药对进行分析，共筛选出20个药物成分，其中白术7个、白芍13个。见表1。

表1 白术-白芍药对的活性成分Tab.1 Active components of Atractylodes macrocephala Koidz-Radix Paeoniae Alba

2.2 潜在作用靶点和疾病靶点网络分析 通过TCMSP对白术-白芍药对的20个有效活性成分进行靶点搜索，然后，通过UniProt数据库检索，将检索对象设定为“Homo sapiens”，整理去重后获得103个标准化基因靶点，白术18个、白芍85个。剔除无法转换的靶点及有效成分后，使用 Cytoscape 3.7.2软件构建化合物-靶点网络图。见图1。然后利用GeneCards、OMIM数据库收集肝纤维化的相关靶点，筛选去重后获得1 731个疾病靶点。

图1 药物-活性成分-靶点网络图Fig.1 Drug-component-target network

2.3 交集基因的收集和药物-成分-基因-疾病网络构建 通过网站Venny 2.1.0将上述获取的潜在作用靶点与肝纤维化相关的疾病靶点进行匹配，得到共同靶点53个，并将其作为候选靶点。见图2。将得到的有效活性成分和交集靶点导入Cytoscape 3.7.2中进行网络构建，得到“药物-成分-靶点-疾病”关系网络图。见图3。 芍药苷、β-谷甾醇、山柰酚、（+）-儿茶素、3β-乙酰氧基苍术酮等是白术-白芍药对干预肝纤维化的关键活性成分；前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS2）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因、Bcl-2关联X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、过氧化物酶体增生激活受体γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）等是该药对抗纤维化的关键靶点。

图2 药物作用靶点和肝纤维化相关靶点交集Fig.2 Interaction of herb related targets and liver fibrosis related targets

图3 药物-活性成分-靶点-肝纤维化网络图Fig.3 Drug-component-target-liver fibrosis network

2.4 PPI网络分析 将获得的53个交集靶点输入String在线数据库，选择“Multiple proteins”选项，限定物种为“Homo sapiens”，蛋白质参数评分值＞0.7，去掉游离节点，分析得到PPI网络，将上述结果输入Cyttoscape 3.7.2软件中可视化，获得 PPI网络图。见图4。 网络图涵括47个节点 （Nodes）、206条边（Edges），Degree值为节点中心度，数值越大代表此节点与其他节点的关系更密切。根据Degree值将蛋白从大到小排列，以Degree值≥13为筛选条件，共获得11个关键靶点，包括蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、白细胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）、丝裂原激活蛋白激酶8（mitogen activated protein kinase 8，MAPK8）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。 见表2。

表2 PPI网络靶点信息（前11位）Tab.2 Target information on PPI network（Top 11）

图4 PPI网络Fig.4 PPI network

2.5 GO功能分析、KEGG代谢通路富集分析结果应用Metascape对筛选出的53个共同靶点基因进行GO和KEGG富集分析，得到白术-白芍药对治疗肝纤维化可能的分子机制与生物通道。

GO富集分析结果包括BP条目20条、CC条目11条和MF条目18条，提示白术-白芍药对的作用涉及细胞增殖和凋亡、细胞生物调控、细胞生物合成、蛋白质结合、酶结合等功能，其中BP涉及脂多糖应答有毒物质凋亡信号通路、活性氧物种代谢过程等，MF主要涉及蛋白质同源二聚化活性核受体活性等，CC包括膜筏、胞质核周区域等。见图5。

图5 GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis

KEGG富集分析显示共同靶点所富集的通路主要与炎症、癌症、动脉粥样硬化、细胞凋亡等相关。显著性程度较高的通路为糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体（advanced glycosylation end product-receptor of advanced glycosylation end product，AGE-RAGE）信号通路、癌症信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路、铂剂耐药通路、大肠癌通路、小细胞肺癌通路、肝细胞癌通路等。见图6。

图6 KEGG信号通路富集分析Fig.6 KEGG function enrichment analysis

3 讨论

肝纤维化，属于中医学“臌胀”“积聚”的范畴，病位在肝，又与脾、胃、肾密切相关。慢性肝损伤的长期存在往往是导致肝纤维化发生的重要因素，中医药可以有效减缓纤维化发展，并及时阻断其后续传变。白术-白芍药对广泛运用于肝病的治疗，体现了中医学肝脾同治的理论与治未病思想[8-9]。

现代药理学研究表明，白术主要含有挥发油类、多糖类、黄酮类等活性成分，具有修复胃黏膜、抗炎、免疫调节等药理作用，对胃肠道、免疫系统疾病等有一定治疗作用[10-11]。白芍主要含有萜类、苷类、黄酮类和多糖类等活性成分，具有抗炎、抗菌、抗自身免疫性疾病等药理作用[12]。

本研究发现白术-白芍药对干预肝纤维化的潜在活性成分有20个，如3β-乙酰氧基苍术酮、8β-乙氧基苍术内酯Ⅲ、芍药苷、β-谷甾醇、谷甾醇、山柰酚、（+）-儿茶素等。芍药苷是芍药的主要成分，可能通过抑制NF-κB通路激活，从而起到保肝作用[13]；又可下调抗凋亡基因Bcl-2表达，上调自噬相关蛋白Beclin1表达，减轻葡聚糖硫酸钠诱导的慢性溃疡性结肠炎[14]。 谷甾醇通过Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）/NF-κB和核苷酸结合寡聚结构域样受体家族3（nucleotide binding oligomerization domainlike receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎性小体信号通路缓解肠黏膜功能障碍、调节氧化应激与炎症反应[15]。儿茶素和槲皮素可通过抑制TLR4-髓样分化因子88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）介导的 NF-κB和MAPK信号通路的激活，从而发挥协同抗炎作用[16]。

成分-靶点-疾病网络与PPI网络分析得出，AKT1、IL-6、MAPK8、PTGS2、Bcl-2、Bax、PPARG等靶点与白术-白芍药对在肝纤维化方面的关联性较高。MAPK8又被称为c-Jun氨基末端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1），是MAPKs家族的重要成员之一，参与细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种过程[17]。PTGS2即环氧合酶2，在调节炎症反应中起关键作用[18]，研究证明其可通过诱导线粒体自噬而抑制肝癌细胞的生长[19]。一项系统评价研究提示，PTGS2表达可能与大肠癌患者的肿瘤复发风险增加和大肠癌特异性生存率降低有关[20]。Bcl-2与Bax同属于Bcl-2家族，在细胞凋亡中起重要作用[21]。近期研究发现，Bcl-2拮抗剂可显著减少肠道纤维化小鼠的胶原生成，显示了Bcl-2拮抗剂对纤维化的预防作用，这可能与抑制转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导的成肌纤维细胞分化相关因子的表达有关[22]。结合本研究结果，提示Bcl-2与Bax是白术-白芍药对干预肝纤维化的关键靶点。

PPARG在糖稳态维持和脂质代谢中起着重要作用，而且在肾细胞癌和肺鳞状细胞癌中具有促进细胞凋亡、抑制癌细胞迁移和增殖的作用[23-24]。Winkler等[25]验证了微小RNA（micro RNA，miRNA）网络可通过多种途径发挥抗纤维化作用，而这些miRNA受转录因子PPARG的调控。Liu等[26]研究发现，PPARG可调节膀胱上皮细胞线粒体功能、防止鳞状细胞分化、控制膀胱上皮细胞中的NF-κB信号通路传导，并能够调节膀胱上皮细胞再生过程中的免疫反应，这一点与PTGS2相似。

AKT1是3种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，调节机体生长代谢和血管生成等多个过程。研究显示，AKT1可以延缓肝癌发生[27]，因此白术-白芍药对可能通过调节AKT1诱导血管新生、保护血管，从而改善肝纤维化。

KEGG通路富集分析结果发现，白术-白芍药对治疗肝纤维化调节的关键信号通路主要有AGERAGE、NF-κB等。Zhou等[28]研究显示，白术-白芍药对可通过下调MAPK和NF-κB通路中的关键因子，抑制脂多糖诱导的炎症反应，提示白术-白芍药对可能通过抑制炎症反应而发挥抗纤维化的作用。

综上所述，本研究结果提示白术-白芍药对通过作用于AGE-RAGE、NF-κB等信号通路，影响PTGS2、Bcl-2、BAX、PPARG、AKT1、IL-6、MAPK8等细胞因子表达，从而发挥抗纤维化的作用。肝纤维化是多种通路、多靶点参与的结果，因此逆转肝纤维化也需要多靶点协同，本研究为下一步开展白术-白芍治疗肝纤维化的机制研究提供了方向。