基于1H-NMR血清代谢组学的阿尔茨海默病肾虚精亏证生物学机制及地黄饮子的干预作用研究

帅月圆，韩 诚，2，曹建华，李少创，秦亚莉，2

（1.山西中医药大学中医脑病学山西省重点实验室，山西 晋中030619；2.山西中医药大学基础医学院，山西 晋中030619；3.山西大学中医药现代研究中心，山西 太原030006）

阿尔茨海默病（Aizheimer's disease，AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，其主要特征为进行性认知功能障碍和记忆力减退以及行为改变［1］。据WHO报道，目前全球共有痴呆症患者约5000万，以AD患者为主［2］。该病早期难以察觉，确诊时多已发展到中晚期，给患者的日常生活、工作及社交带来严重影响。AD的具体发病机制目前尚未完全研究透彻，存在多种假说。早期诊断的困难、发病机制的不明确、治疗效果的不显著以及病程的不可逆都表明AD的危害程度，随着我国老龄化进程的不断发展，对于AD的早期防治越来越显现出重要的医学价值和社会意义。

AD在中医学中归属于痴呆范畴，其病机为髓减脑消，神机失用，病性为本虚标实，本虚又以肾虚为关键。肾主骨生髓与脑相通，AD患者多年老体衰，肾精渐亏，脑髓失于充养而消减，髓海空虚则心无所虑，精明失聪，神无所依而出现痴呆的各种表现［3］。故中医对于AD的治疗多从肾虚精亏着手，地黄饮子作为经典补肾方剂常被用于AD肾虚精亏证的治疗。研究表明，地黄饮子可以通过减轻胆碱能系统损害、抗氧化和减少自由基、抑制神经细胞凋亡发挥对AD的治疗作用［4］。本研究运用经典补肾方剂地黄饮子对AD肾虚精亏证进行干预，分析其内源性代谢物的变化，探寻AD肾虚精亏证的生物学机制以及地黄饮子干预AD肾虚精亏证的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2016-0011］，动物饲养于山西中医药大学动物房，经适应性喂养1周后开始实验。

1.1.2 药物与试剂 地黄饮子购于北京同仁堂山西连锁店；Aβ1-42购于杭州中肽生化有限公司（批号：AP0039）；D-半乳糖购于北京索莱宝科技有限公司（批号：D8310-100 g）；重水（D2O）购自美国兰迪斯维尔Norell公司。

1.1.3 实验仪器 脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司，型号：68503）；SorvallTMLegendTMXT/XF离心机（美国/Thermo Scientific）；Morris水迷宫视频跟踪分析系统（上海吉量软件科技有限公司，型号：JLBehvMwMM）；Bruker 600 MHz AvanceⅢNMR Spectrometer（德国布鲁克公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 地黄饮子水煎剂的制备 按地黄饮子各药材（熟地黄、巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉、炮附子、五味子、肉桂、茯苓、麦冬、石菖蒲、远志、薄荷、生姜、大枣质量比12∶9∶9∶9∶9∶6∶6∶6∶6∶6∶6∶6∶3∶3∶3）配比称取药材。加入8倍量蒸馏水浸泡30 min，水煎提取25 min，收集水煎液，再用8倍体积水提取20 min，将2次煎煮药液混合均匀并加热浓缩，每剂中药浓缩为含生药量2 g/mL，4℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 分组与给药 大鼠适应性喂养1周后，按Rand函数随机分为正常对照组、AD肾虚精亏证组、地黄饮子低剂量组（5.2 g/kg）、地黄饮子中剂量组（10.4g/kg）、地黄饮子高剂量组（20.8 g/kg），每组12只。证候造模第5周开始灌胃给药，地黄饮子各剂量组给予相应浓度药液，正常对照组和AD肾虚精亏证模型组灌胃等体积蒸馏水。1次/d，至造模结束为止。

1.2.3 AD肾虚精亏证模型的制备及验证 采用房事不节法［5-6］和腹腔注射D-半乳糖溶液构建肾虚精亏证模型。除正常对照组外的4组大鼠每天下午与处于动情期的雌性大鼠同笼，次日上午取出雄鼠，下午再投入动情期雌性大鼠笼内，如此轮转，连续8周。除正常对照组外的4组大鼠每天腹腔注射D-半乳糖（50 mg/kg），连续8周。第8周在肾虚精亏证模型的基础上采用侧脑室注射Aβ1-42制备AD大鼠模型。除正常组外的大鼠固定在脑立体定位仪上，以微量注射器将5 μL预先孵育好的Aβ1-42混悬液缓慢注射到大鼠脑部侧脑室区域。注射1周后用Morris水迷宫检测各组大鼠的学习记忆能力。Morris水迷宫实验主要包括定位航行和空间探索两部分。定位航行实验总共5 d，记录大鼠每次自入水直至寻找到目标象限平台并爬上平台的时间即逃避潜伏期，时长最大值为120 s。第6天进行空间探索实验，记录大鼠60 s内穿越平台的次数以及在目标象限停留的时间。

1.2.4 样品收集与制备 造模结束后麻醉开腹，腹主动脉取血，在4℃、3000 r/min离心10 min，取上清液后移至EP管中，于-80℃冰箱中保存。取血清样品450 μL，加入350 μL D2O，斡旋振荡混匀后低温离心，取上清液600 μL置于5 mm核磁管中，在Bruker 600 MHz核磁仪上测定，设置主要参数：采样数据点数（TD）为65 536，扫描次数（NS）为64次，扫描谱宽（SWH）为12 019.23 Hz，傅里叶变换为0.183 Hz，脉冲间隔D1为1s，延迟时间为5.0 s。血清样品采用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Grill）脉冲序列，以衰减蛋白质和脂蛋白的宽峰。

1.2.51H-NMR谱图处理 谱图处理采用MestReNova 8软件进行分析。所有谱图进行手动相位、基线调整。血清谱图以肌酐的化学位移（δ3.04）为标准进行校正，以0.01对化学位移区间δ0.60~9.00进行分段积分，其中δ4.67~4.89（残余水峰）不进行积分，并将积分数据进行归一化，导入Excel中进行下一步多元统计分析。

1.3 统计学方法

将上述处理的积分数据输入到SIMCA-P+13软件进行多元统计分析，采用偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）进行组间比较和模型验证；采用正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）的S-plot图，寻找对分类贡献较大的变量，选择（variable importance in the projection，VIP）＞1的变量作为潜在生物标记物的鉴别依据。采用Graphpad Prism 8.0统计，数据采用One-Way ANOVA进行方差分析，两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学结果

定位航行实验中，随着大鼠训练时间的推移，AD肾虚精亏证组逃避潜伏期较正常对照组明显延长，提示模型大鼠的学习记忆能力存在缺陷；与AD肾虚精亏证组比较，地黄饮子各剂量组的逃避潜伏期均缩短，说明地黄饮子可以改善AD肾虚精亏证大鼠的学习记忆能力（图1A）。空间探索实验中，与正常对照组相比，AD肾虚精亏证组大鼠穿越平台次数明显减少（P<0.001），经地黄饮子中剂量和高剂量干预后，平台穿越次数升高（P<0.01和P<0.05）（图1B）；目标象限停留时间AD肾虚精亏证组较正常对照组明显缩短（P<0.01），经地黄饮子中剂量和高剂量干预后，目标象限停留时间延长（P<0.01和P<0.05）（图1C）。

图1 Morris水迷宫检测结果

2.2 血清1H-NMR谱图指认

参考有关文献［7］及代谢物数据库HMDB（http：//www.hmdb.ca），结合本实验1H-NMR谱图对大鼠血清中的代谢产物进行指认，共指认出23种内源性代谢产物，具体结果见图2和表1。

表1 大鼠血清样本1H-NMR谱图主要代谢物归属

图2 正常对照组大鼠血清样本1H-NMR谱图

2.3 多元统计分析

为进一步分析各组间内源性代谢物的差异，对复杂数据降维处理后进行多元统计分析。采用有监督的PLS-DA方法对各组血清样本数据进行代谢轮廓分析，结果见图3A。正常对照组与AD肾虚精亏证组的散点可以完全分开，说明AD肾虚精亏证组大鼠机体的代谢状态存在明显的改变。模型验证结果显示Q2回归线与纵轴相交于零点以下，且左侧Q2实验值低于右边的原始值，表明所建模型可靠性较高（图3B）。

图3 大鼠血清样本PLS-DA散点图（A）和相应的模型验证图（B）

2.4 血清差异代谢物的筛选

为进一步确定AD肾虚精亏证造模前后大鼠血清内源性代谢物的差异，采用OPLS-DA方法对样品进行分析，得到OPLS-DA得分图（图4A）和相应的S-plot载荷图（图4B）。通过S-plot图结合VIP值＞1以及P＜0.05寻找差异代谢物，共得到14个峰面积具有显著性差异的内源性代谢物。由图5可知，与正常对照组相比，AD肾虚精亏证组血清中缬氨酸、异亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酰乙酸、亮氨酸、蛋氨酸含量升高，脂蛋白、N-乙酰糖蛋白、胆碱、甘氨酸、磷酸胆碱、β-葡萄糖、α-葡糖糖含量降低。地黄饮子可以有效调节以上差异代谢物接近正常对照组水平，其中地黄饮子低剂量可以升高脂蛋白的含量，降低异亮氨酸、乙酰乙酸的含量；地黄饮子中剂量可以升高脂蛋白、N-乙酰糖蛋白、磷酸胆碱的含量，降低乳酸、乙酰乙酸、丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸的含量；地黄饮子高剂量可以升高脂蛋白、N-乙酰糖蛋白、胆碱、磷酸胆碱、甘氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖的含量，降低乳酸、丙氨酸、乙酰乙酸、亮氨酸的含量。以上3组中地黄饮子中剂量组、地黄饮子高剂量组的差异代谢物水平与正常对照组最为接近。

图4 正常对照组与AD肾虚精亏证组血清样本OPLS-DA得分图（A）和相应的S-plot载荷图（B）

图5 大鼠血清中差异代谢产物相对峰面积

3 讨论

糖酵解是放能反应，它能供给生物体部分能量，尤其是在生理或病理条件下提供生命活动所需的能量。其关键代谢物质丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下最终还原为乳酸［8］。当酵解过度会引起乳酸积累过多而引起酸中毒。本研究中AD肾虚精亏组与正常对照组相比乳酸含量升高，提示AD肾虚精亏证状态下机体存在严重的乳酸堆积；经地黄饮子干预后乳酸含量降低，表明地黄饮子可以改善机体的乳酸代谢水平。

乙酰乙酸是脂肪酸在肝脏中不完全氧化的产物，其作为酮体代谢中的一环，是某些器官的主要能源分子［9］。正常情况下，大脑的主要能源是葡萄糖，但在饥饿和患糖尿病时，大脑可有效利用酮体为其供能。长期饥饿时，脑所需能量75%来自乙酰乙酸。本研究中与酮体代谢相关的是乙酰乙酸，其含量的升高提示机体内通过脂肪酸氧化的产能降低［10］。

N-乙酰糖蛋白、α-葡萄糖、β-葡萄糖是机体糖代谢主要物质，在本研究中，AD肾虚精亏证组血清的N-乙酰糖蛋白、β-葡萄糖和α-葡萄糖的含量降低，提示机体内葡萄糖消耗增加，能量代谢障碍严重；经地黄饮子干预后三者的含量升高，表明地黄饮子可以通过纠正糖代谢紊乱来改善机体的能量代谢障碍。

缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸三者都为支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA），并且都属于必需氨基酸，支链氨基酸是唯一一类在肝外代谢的氨基酸，主要在骨骼肌，约占骨骸肌蛋白质必需氨基酸的35%，是体内主要供能的氨基酸［11］。研究表明机体BCAA含量的升高可能会通过影响血清素能系统从而增加AD风险［12］。在本研究中，AD肾虚精亏组血清中支链氨基酸以及肌肉组织蛋白的主要底物之一的蛋氨酸含量高于正常对照组，表明在肾虚精亏证状态下机体能量消耗严重，能量供应无法满足体内更旺盛的能量需求从而引起骨骼肌蛋白分解代谢水平的加强［13］。在地黄饮子干预后，亮氨酸和蛋氨酸的含量降低。

丙氨酸在肌肉组织中浓度最高，其作为氨的载体，经血液将氨运送到肝脏后生成丙酮酸，丙酮酸经糖异生途径合成葡萄糖，为机体提供能源。本研究中AD肾虚精亏组丙氨酸与正常对照组相比呈升高状态，经地黄饮子干预后含量降低，表明在肾虚状态下机体的能量消耗巨大。

肾作为先天之本，其主要生理功能为主藏精、主水和主纳气。肾主水是指肾有主持和调节人体水液代谢的功能，其实现又依赖肾的蒸腾气化作用。病理情况下，肾中精气亏虚，气化功能失常，脂质代谢作为机体水液代谢重要的一环同样也会受到干扰［14］。脂蛋白运输甘油三酯可用于能量代谢［15］。胆碱和胆碱磷酸是构成细胞膜的主要物质，血清中胆碱和胆碱磷酸的降低，提示细胞膜以及膜性结构如线粒体、内质网的脂质代谢受损［16］。本研究中AD肾虚精亏组中脂蛋白、胆碱和胆碱磷酸的含量呈降低状态，经地黄饮子干预后又呈升高状态，表明AD肾虚精亏证与脂质代谢紊乱关系密切。

当人步入老年时，肾精开始逐渐亏虚，肾精不足则髓海不充，于是脑的正常机能也随之受到影响，轻则表现出记忆力衰退等症状，重则发病为AD，故肾虚精亏证是AD的发病基础。在本研究中，缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸归属于氨基酸代谢，N-乙酰糖蛋白、β-葡萄糖、α-葡糖糖、乳酸归属于糖代谢，乙酰乙酸、脂蛋白、胆碱、磷酸胆碱归属于脂类代谢，而机体的主要能量来源正是来自糖、脂、蛋白质三类物质的氧化，故以糖、脂类、氨基酸代谢为主的能量代谢紊乱（不足）可能是导致AD肾虚精亏证发生的生物学机制。

肾虚往往提示人体各项脏腑功能减退或衰弱，从而导致体内的各项循环和代谢减慢。形体消瘦、腰酸膝软和懈惰思卧是AD肾虚精亏证证候表现出的主要症状中的一类，本研究表明AD肾虚精亏证存在氨基酸代谢紊乱，本来主要存在于骨骼肌的支链氨基酸被大量释放到血清中为机体供能，在内导致骨骼肌蛋白分解，在外则表现为形体消瘦。腰膝酸软或与机体内乳酸代谢紊乱堆积于肌肉有关，而懈惰思卧则可能是机体能量供应不足的征兆。

综上，AD肾虚精亏证组存在糖代谢、氨基酸代谢、脂质代谢三个方面的紊乱，三者均以能量代谢紊乱为主要特征，共同构成AD肾虚精亏证的证候生物学基础；地黄饮子通过部分改善糖代谢、氨基酸代谢、脂质代谢的紊乱起到对AD肾虚精亏证的治疗作用。