施肥模式对青稞田土壤潜在固氮速率和自生固氮微生物群落结构的影响*

马瑞萍,戴相林,刘国一,谢永春,高小丽,高 雪

氮是构成生命体(如蛋白质和核酸)必不可少的元素,也是陆地生态系统中限制植物生长和初级生产的关键营养元素[1]。自Berthelot发现微生物能够固定大气中的氮素以弥补土壤氮损失以来,人们对生物固氮的研究已经超过了130年[2]。生物固氮是陆地生态系统中“新”氮的重要来源,主要通过共生固氮和自生固氮两种途径发生[3]。相对于共生固氮,自生固氮虽然速率低,但时空分布广泛,在缺乏固氮植物或氮匮乏的土壤生态系统中,自生固氮量约为每年0～60 kg(N)·hm-2,被认为是氮素输入的重要来源[3-6]。因此,自生固氮作为一种环境友好型和可持续性的氮素供应方式,可替代部分无机氮肥,为解决集约化农业生产中过量施氮导致的能源消耗和生态环境污染问题提供了替代方案。

固氮微生物是执行生物固氮的主要成员。系统发育和代谢途径(自养型、异养型、无机化能营养型、光合异养型和产甲烷型)的高度多样性[3,7],使固氮微生物在陆地及水生生态系统均有广泛分布[8],且易受作物类型、土壤理化性质、时空分布和气候因子等多重因素的影响[9]。施肥是实现作物高产和维持土壤肥力的重要农艺措施。但前人研究表明,固氮微生物丰度、多样性、活性和群落组成对不同施肥模式的响应并不完全一致。如施用化肥,尤其是氮肥会降低固氮微生物丰度、多样性和活性[10-11],而施用有机肥则通常呈相反趋势[12]。这可能是由于外源有机物的添加为固氮微生物的生长提供了碳源和能源,进而刺激了微生物的固氮作用[13]。但也有研究发现,长期增施有机肥(猪粪、秸秆或绿肥)会降低固氮微生物丰度、群落多样性[14-17]或活性[18],且不同有机物料对固氮微生物的影响效果也存在差异。如Liao等[19]研究发现,相比于氮磷钾配施秸秆而言,氮磷钾配施鸡粪能够显著提高固氮速率。固氮微生物对施肥的不同响应,可能是由于有机物料碳源质量[20]或施肥引起的土壤理化性质变化所致,如pH[21]、土壤有机碳[22]和氮、磷养分有效性[11,23]等。另外,固氮微生物群落结构通常与土壤固氮速率密切相关[24-25]。综上所述,不同施肥模式下驱动固氮过程的关键理化因子及微生物还有待进一步探索[26]。

青稞(Hordeum vulgareL.)是西藏高原主要的粮食作物,其播种面积和产量分别占西藏粮食作物总播种面积和总产量的75.3%和76.3%。因此,维持青稞高产稳产是实现西藏粮食安全的重要保障。施肥是提高作物产量的重要途径,长期定位试验表明化肥对我国粮食产量的贡献率高达40%左右[27]。但近20年来,随着我国化肥用量的高速增长,化肥利用率却始终不高[28]。另一方面,我国是农业生产大国,有机肥料资源丰富,基础资源实物量每年约57亿t,但有机肥料资源利用率也较低[29]。养分资源的不合理和不充分利用会引发一系列生态环境问题,如土壤酸化退化、地下水硝酸盐污染和温室气体增排等[30]。西藏作为青藏高原的主体,具有海拔高、紫外线强和低温干旱的气候特点,是典型的生态脆弱区[31]和气候变化敏感区[32]。然而不同施肥模式对西藏高原青稞田土壤固氮速率和固氮微生物影响的报道还较少见。因此,本研究的目的是明确合理的施肥模式,探明固氮微生物丰度、群落结构和固氮活性对不同施肥模式的响应。这对减施氮肥,保护青藏高原生态环境,促进西藏高原农业的可持续性发展具有至关重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本研究在西藏自治区农牧科学院4号试验地长期肥料定位试验田进行。试验地位于西藏自治区拉萨市(29°38＇N,91°02＇E),海拔3662 m,属高原温带半干旱季风气候,年降水量200～510 mm,集中在6-9月,年均气温7.4 ℃,年无霜期100～120 d,全年日照3000 h以上。试验地在2017年进行改造,小区间用1 m高水泥隔离层隔开,防止小区间土壤养分和水分渗透。耕层土壤来源于拉萨周边自然农田,土层厚度60 cm。试验开始于2018年,前茬作物为青稞,土壤类型为沙壤土。供试青稞品种为‘藏青2000’,播种密度为225 kg·hm-2。试验开始前土壤(0～20 cm)基础理化性质如下:有机碳11.6 g·kg-1、全氮1.20 g·kg-1、全磷0.90 g·kg-1、全钾22.7 g·kg-1、碱解氮82.2 mg·kg-1、有效磷48.1 mg·kg-1、速效钾96.3 mg·kg-1、pH 8.07(水土比=2.5∶1)。

1.2 试验设计与管理

田间试验采用随机区组设计,共设6个处理,分别为:1)撂荒(CK0); 2)不施肥(CK); 3)施氮磷钾化肥(F); 4)单施羊粪(M); 5)氮磷钾化肥+羊粪(FM);6)氮磷钾化肥+秸秆(FS)。小区面积为20 m2,每个处理4次重复。各施肥处理养分投入量如下:F处理化肥N、P2O5和K2O养分投入量分别为90 kg·hm-2、76 kg·hm-2和45 kg·hm-2; M处理羊粪投入量为5 t·hm-2;FM处理化肥N、P2O5和K2O养分投入量分别为60 kg·hm-2、50.1 kg·hm-2和30 kg·hm-2,羊粪投入量为1.67 t·hm-2; FS处理化肥N、P2O5和K2O养分投入量分别为90 kg·hm-2、76 kg·hm-2和45 kg·hm-2,秸秆投入量为150 kg·hm-2。氮肥为尿素(N 46%),磷肥为磷酸二铵(N 18%,P2O546%),钾肥为氯化钾(K2O 60%)。有机肥为腐熟羊粪,秸秆为上一年生产的青稞秸秆。秸秆(粉碎长约3～5 cm)和羊粪作基肥于播种前一年冬灌前撒施、翻耕。其中,秸秆含全碳315.6 g·kg-1,全氮4.56 g·kg-1,全磷2.01 g·kg-1,全钾12.2 g·kg-1,C/N=69.2; 羊粪含全碳292.1 g·kg-1,全氮16.8 g·kg-1,全磷3.66 g·kg-1,全钾5.08 g·kg-1,C/N=17.4。磷酸二铵和氯化钾作基肥一次性施入。尿素作基肥、分蘖肥和拔节肥分3次施入。青稞于每年4月中下旬播种,8月中下旬收获。本次研究选择除撂荒处理的其余5个处理(随机选择3个重复)进行分析。

1.3 土壤样品采集

于2019年8月,青稞收获后以“S”型多点混合法,采集各小区耕层(0～20 cm)土壤样品。随后将土壤样品放入冷藏箱内带回实验室,过2 mm筛去除碎石和植物碎屑进行后续分析。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 土壤理化性质的测定

参照鲍士旦[33]的《土壤农化分析》方法,采用硫酸-重铬酸钾氧化法测定土壤有机碳含量; 采用pH计测定土壤pH(水土比=2.5∶1); 采用凯氏定氮法测定土壤全氮含量; 采用0.5 mol·L-1碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定土壤有效磷含量; 采用1 mol·L-1中性醋酸铵浸提-火焰光度计法测定土壤速效钾含量; 采用105 ℃烘干-称重法测定土壤含水量; 采用0.01 mol·L-1氯化钙浸提(1∶10,w/v),AA3连续流动分析仪测定土壤铵态氮和硝态氮含量。

1.4.2 土壤潜在固氮速率的测定

根据Hsu等[24]的操作步骤,采用15N标记法测定土壤潜在固氮速率,并稍作改动。具体方法如下:将2 g新鲜土样放入12 mL密封顶空瓶(Exetainer;Labco Ltd.,Lampeter,Ceredigion,UK)中,调节土壤含水量为田间持水量的70%。将瓶内空气抽真空,并用20% O2(v/v)和80% N2(v/v)填充(15N丰度99%,上海稳定性同位素工程技术研究中心),混合均匀,每个样品重复3次。未作标记的N2做平行对照。样品在黑暗条件下室温培养22 d[18]。培养结束后,将土壤样品冻干并研磨过0.15 mm筛,通过元素分析仪-同位素比值质谱仪(EA-IRMS)(Vario Isotope Cube-Isoprime; Elementar,Langenselbold,Hesse,Germany)联用技术测定土壤全氮含量和15N丰度。根据标记样品和未标记样品全氮15N含量之差,除以培养时间,计算土壤潜在固氮速率[potential nitrogen fixation rate,PNFR,μg(N)·kg-1·d-1]。

1.4.3 DNA提取与实时荧光定量PCR分析

称取0.25 g土壤样品,利用MoBio PowerSoilTMDNA Isolation Kits(MO BIO Laboratories Inc.,Carlsbad,CA,USA)试剂盒,按照操作说明提取土壤总DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量,用Nanodrop分光光度计(Nanodrop 2000)测定DNA的浓度。采用实时荧光定量PCR方法测定nifH基因拷贝数。定量PCR在ABI 7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,California,USA)上进行。选用引物nifH-F和nifH-R扩增固氮微生物nifH基因[34],PCR反应体系如下:2×Taq Plus Master Mix 10 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,再用超纯水(ddH2O)补至20 μL。PCR反应条件如下:95 ℃,30 s; 40个PCR循环(95 ℃,5 s;60 ℃,40 s)。根据Poly等[35]方法,获得含有nifH基因的重组质粒。以质粒10倍梯度稀释浓度的对数值为横坐标,定量PCR反映的循环数(Ct值)为纵坐标,得到标准曲线。溶解曲线总是出现单峰,扩增效率为90.6%,R2=0.999。

1.4.4 高通量测序与生物信息学分析

固氮微生物nifH基因采用nifH-F和nifH-R引物扩增。PCR反应体系:5×ExTaq缓冲液5.0 μL,2.5 μmol·L-1dNTPs 2 μL,上、下游引物各1.0 μL(10 μmol·L-1),DNA模板2 μL,ExTaq(5 U·μL-1)0.25 μL,超纯水(ddH2O)补至25 μL。PCR扩增条件:94 ℃ 预变性5 min,94 ℃ 变性30 s,58 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸60 s,循环32次,循环结束后72 ℃ 保持7 min,4 ℃ 条件下结束。为了区分样品,扩增时在每个样品的上游引物5＇端,添加长度为8个碱基的特异性碱基序列(barcode)。将扩增的nifH基因PCR产物经AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)纯化后,使用Quanti-Fluor™-ST(Promega,USA)蓝色荧光定量系统测定浓度,用Illumina Miseq PE300平台进行双末端测序分析。测序由北京奥维森科技有限公司完成。测序数据上传至中国科学院北京基因组研究所BIG数据中心的基因组序列档案库(Genome Sequence Archive,GSA)(https://bigd.big.ac.cn/gsa/),编号CRA004010。

原始数据下机后,采用Pear(v0.9.6)软件对测序结果进行质量过滤和优质序列拼接,得到有效数据。具体参数如下:1)去除打分值低于20,含有模糊碱基,引物错配序列; 2)根据PE的overlap关系对两端序列进行拼接(merge)处理,最小overlap设置10 bp,错配率为0.1,得到Fasta序列; 3)使用自比对(denovo)方法去除Fasta序列的嵌合体,同时去除不合要求的短序列。用Vsearch(v2.7.1)软件按照97%相似性将全部序列聚类,去除singleton的OTU,得到代表性序列和OTU表。采用blast算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,比对nt数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),并在各个水平注释群落物种信息。应用Mothur(v.1.34.4)软件,按照样本最小序列抽平并进行后续分析。

1.5 数据处理

利用Excel 2019对试验数据进行整理。利用SPSS软件(Version 24.0,IBM,USA)通过单因素方差分析(one-way ANOVA)和邓肯(Duncan)多重比较法检验不同处理间土壤理化性质、固氮微生物丰度和群落结构相对丰度的差异显著性(LSD,α= 0.05)。利用R软件(Version 4.0.3)进行如下分析:采用“corrplot”包计算固氮微生物丰度、群落组成和土壤理化性质之间的Spearman相关关系; 基于Bray-Curtis距离,通过主坐标分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA)并结合置换多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA),检验不同处理间微生物群落结构是否存在显著差异(“Vegan”包); 通过典范对应分析(Canonical Correlation Analysis,CCA)与蒙特卡洛置换检验(Monte Carlo Permutation test)相结合,揭示固氮微生物群落结构与环境因子(膨胀因子,VIF ＜ 10)的关系。

2 结果与分析

2.1 不同施肥模式下土壤理化性质的变化

不同施肥模式显著改变了青稞田土壤理化性质(表1)。不同施肥模式下土壤有机碳和全氮含量由高到低,表现为:M＞FM＞FS＞F＞CK。与CK处理相比,施用有机肥的处理(M、FM和FS)显著提高了土壤有机碳和全氮含量(P＜0.05),且不同有机肥处理之间也存在显著性差异(P＜0.05)。不同施肥模式土壤C/N为9.50～10.22,其中M处理下土壤C/N最高,CK处理下土壤C/N最低。土壤含水量在M处理下最高(14.30%),CK处理下最低(12.17%); 与CK处理相比,施肥处理显著提高了土壤含水量。铵态氮含量由高到低,表现为:FM＞FS＞M＞CK＞F; 与CK处理相比,有机无机肥料配施处理(FM和FS)显著提高了土壤铵态氮含量(P＜0.05)。 硝态氮、有效磷和速效钾含量由高到低,均表现为:M＞FM＞F＞FS＞CK,与CK处理相比,施肥处理显著提高了上述养分指标的含量。pH变化范围在8.10～8.44,与CK处理相比,施肥处理显著降低了土壤pH。

2.2 不同施肥模式下土壤固氮微生物丰度和潜在固氮速率的变化

不同施肥模式显著改变了固氮微生物丰度和土壤潜在固氮速率(图1)。结果表明,不同施肥处理下固氮微生物丰度变化范围为4.33×106～8.65×106copies·g-1(soil),各处理固氮微生物丰度由高到低表现为:M＞FM＞CK＞F＞FS,且不同施肥处理间固氮微生物丰度存在显著性(P＜0.05)差异; 而土壤潜在固氮速率在CK处理下最高(4.07 μg·kg-1·d-1),FS处理下最低(2.63 μg·kg-1·d-1)。与CK处理相比,施肥尤其是施用有机肥处理(M、FM和FS)显著降低了土壤潜在固氮速率(P＜0.05)。

2.3 土壤理化性质与固氮微生物丰度和潜在固氮速率之间的关系

固氮微生物丰度和潜在固氮速率对土壤理化性质响应不同(图2A)。Spearman相关性分析表明,固氮微生物丰度与土壤有机碳(r=0.589)、全氮(r=0.688)、硝态氮(r=0.614)和速效钾(r=0.661)显著正相关(P＜0.05); 潜在固氮速率与pH(r=0.682)显著正相关(P＜0.05),而与铵态氮(r=-0.743)、硝态氮(r=-0.475)和有效磷(r=-0.325)显著负相关(P＜0.05)。逐步回归分析进一步表明,全氮和铵态氮分别是显著影响和最佳解释固氮微生物丰度和潜在固氮速率的环境因子(图2B-2C)。

2.4 不同施肥模式下土壤固氮微生物群落结构的变化

不同施肥模式改变了固氮微生物纲和属水平的组成(图3A和3B)。在纲(class)水平,不同施肥处理下,α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,3.2%～8.8%)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria,24.5%～61.0%)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria,1.9%～13.4%)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria,1.2%～19.9%)和丰佑菌纲(Opitutae,0.5%～5.2%)为青稞田土壤固氮菌优势纲(相对丰度＞1%)。与CK处理相比,F处理显著(P＜0.05)降低了丰佑菌纲的相对丰度,增加了未分类纲(Unidentified)的相对丰度; M处理显著降低了丰佑菌纲和β-变形菌纲的相对丰度,增加了α-变形菌纲、γ-变形菌纲和未分类纲的相对丰度; FM处理显著降低丰佑菌纲的丰度; 而FS处理与CK处理间,固氮微生物群落组成无显著性差异(图3A)。

在属(genus)水平,不同施肥处理下,假食酸菌属(Pseudacidovorax,9.4%～25.4%)、固氮弧菌属(Azoarcus,0.8%～15.6%)、地杆菌属(Geobacter,1.5%～12.9%)、红长命菌属(Rubrivivax,3.1%～8.3%)、贪噬菌属(Variovorax,0.6%～4.0%)、Azohydromonas(3.5%～9.4%)、动胶菌属(Zoogloea,0.9%～9.9%)、脱氮单孢菌属(Dechloromonas,0.4%～2.6%)、念珠藻属(Nostoc,1.2%～8.2%)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium,1.3%～5.2%)、鱼腥藻属(Anabaena,0.9%～6.1%)、固氮螺菌属(Azospirillum,0.8%～1.8%)、Skermanella(0.6%～1.7%)和甲基细菌属(Methylobacter,0.3%～18.1%)为青稞田土壤固氮菌优势属(相对丰度＞1%)。与CK处理相比,F处理显著(P＜0.05)降低了固氮弧菌属的相对丰度,增加了固氮螺菌属和未分类属的相对丰度; M处理显著降低了固氮弧菌属和脱氮单胞菌属的相对丰度,增加了慢生根瘤菌属和甲基细菌属的相对丰度;而FM和FS处理显著降低了固氮弧菌属相对丰度(图3B)。

主坐标分析(PCoA)显示,第1轴和第2轴分别解释了固氮微生物群落方差总变异的35.23%和22.54%。不同施肥模式可大致聚为3类,分别是CK、M和施用化肥的处理(F、FM和FS)。置换多元方差分析(PERMANOVA)表明不同施肥模式显著改变了固氮微生物群落结构(R2=0.461,P=0.001)(图4)。

2.5 土壤理化性质与固氮微生物群落结构的关系

固氮微生物纲水平群落组成和土壤理化性质间的相关性分析表明,α-变形菌纲与硝态氮、速效钾和土壤含水量显著正相关(P＜0.05); β-变形菌纲与土壤C/N(P＜0.01)和含水量(P＜0.01)及速效钾(P＜0.05)显著负相关; γ-变形菌纲与土壤有机碳、全氮、C/N、硝态氮、有效磷、速效钾和含水量显著正相关(P＜0.01); δ-变形菌纲与速效钾(P＜0.05)和含水量(P＜0.01)显著负相关; 而丰佑菌纲与土壤C/N(P＜0.05)、硝态氮(P＜0.05)、有效磷(P＜0.05)、速效钾(P＜0.01)和含水量(P＜0.01)显著负相关(表2)。

表2 土壤理化性质与固氮菌优势纲相对丰度之间的相关性分析Table 2 Spearman correlation between relative abundance of dominated class of diazotroph and soil physicochemical properties

属水平上,多数固氮微生物相对丰度与土壤含水量和碳氮比显著相关(P＜0.05或P＜0.01)(表3)。如地杆菌属、固氮弧菌属、假食酸菌属和脱氮单胞菌属与土壤含水量显著负相关,而念珠藻属、慢生根瘤菌属、鱼腥藻属、固氮螺菌属、甲基细菌属和Skermanella属则相反; 固氮弧菌属、假食酸菌属和动胶菌属与土壤C/N显著负相关,而念珠藻属、鱼腥藻属、固氮螺菌属和甲基细菌属则与土壤C/N显著正相关。此外,有机碳、全氮、硝态氮、有效磷和速效钾均与不同的固氮菌优势属存在显著相关关系。

表3 土壤理化性质与固氮菌优势属相对丰度之间的相关性分析Table 3 Spearman correlation between relative abundance of dominated genera of diazotroph and soil physicochemical properties

通过典范对应分析(CCA)与蒙特卡洛置换检验相结合,进一步揭示影响固氮微生物群落结构的关键理化因子(图5)。结果表明,有效磷(R2=0.895,P=0.001)是显著影响青稞田土壤固氮微生物群落结构的首要因子,其次是pH(R2=0.658,P=0.008)和土壤C/N(R2=0.515,P=0.012)。

3 讨论

3.1 不同施肥模式对固氮微生物丰度的影响

施肥可通过改变土壤养分含量和有效性而影响固氮微生物丰度[36-37]。通过2年的田间试验,本研究发现单施化肥或化肥配施秸秆会显著降低青稞田土壤nifH基因丰度,而单施羊粪或化肥配施羊粪则相反。这与前人的研究结果类似,即长期化肥NPK配施[36]或稻草还田[37]会抑制土壤固氮微生物丰度,而增施禽畜粪便则有利于氮循环基因丰度的增加[38]。但也有研究表明,稻草还田和化肥NPK配施可显著增加nifH基因丰度[22,39],而施用粪肥(猪粪)会抑制固氮微生物的生长[15]。上述研究结果的不一致性,可能是由于固氮微生物易受气候因子、作物类型和土壤性质等多重环境因素的影响[9]。通过对土壤理化性质的进一步分析,我们发现全氮与固氮微生物丰度显著(P＜0.05)正相关,且是影响固氮微生物丰度的主要因子(图2A,2B)。而相比于单施化肥或化肥配施秸秆处理,施用羊粪显著(P＜0.05)提高了土壤全氮含量(表1)。上述发现解释了本研究中羊粪对土壤nifH基因丰度的影响不同于秸秆或化肥的原因。Han等[9]通过对3种不同土壤类型农田固氮微生物丰度和多样性的研究也发现,土壤理化性质中全氮含量与nifH基因丰度相关性最强。这可能是由于全氮含量高的土壤能够维持植物更好地生长,使植物根际分泌更多的碳底物促进固氮微生物生长,因为固氮微生物高度依赖于碳的可利用性[3]。

3.2 不同施肥模式对固氮微生物群落结构的影响

众多研究表明,固氮微生物群落结构对不同施肥模式反应敏感[10,19]。这与本研究结果一致,即不同施肥模式下固氮微生物群落结构相似性大致可以分为3类,分别为CK,M以及F、FM和FS(图4),这可能是由于不同施肥模式下土壤理化性质发生改变引起的。进一步分析发现,有效磷是显著影响青稞田土壤固氮微生物群落结构的主要因子(图5)。Xiao等[23]和Hu等[14]分别通过对喀斯特地貌草原区及东北黑土的施肥试验均表明,磷对固氮微生物群落多样性和组成影响最大。这可能是因为:1)生物固氮是一个非常耗能的过程,每固定1分子N2需要消耗约16分子的ATP,而磷是ATP的重要组成成分[40]。因此,磷在调控固氮微生物生长、群落组成和功能发挥中起着重要作用[22,41]。2)磷的有效性可以强烈影响固氮微生物群落之间的相互作用关系[23]。除有效磷外,我们发现pH和土壤C/N也能够显著影响固氮微生物群落结构,这与王磊等[17]和Yang等[37]的研究结果类似。这可能是由于pH和土壤C/N在调控固氮微生物群落组装过程中发挥着重要作用[42-43]。

本研究发现归属于变形菌门的α-变形菌纲、β-变形菌纲、δ-变形菌纲和γ-变形菌纲及归属于疣微菌门的丰佑菌纲是分布于青稞田土壤的主要固氮微生物类群(图3)。这与前人对旱地非豆科作物内生固氮菌或土壤固氮微生物群落结构的研究相一致[44-46]。另外,我们还发现土壤速效养分(硝态氮、有效磷和速效钾)含量与丰佑菌纲相对丰度显著负相关(表2)。归类于疣微菌门的微生物通常属于寡营养菌[47],而施肥,尤其是化肥或羊粪,会显著提高土壤速效养分含量(表1),这也很好地解释了为什么施肥会降低丰佑菌纲相对丰度(图3A); 在属水平,假食酸菌属在固氮菌优势属中的相对丰度最高(图3B),这可能意味着假食酸菌属在青稞田土壤中发挥着重要的固氮作用。这个推测被前人研究所证实,即假食酸菌属是活跃的固氮微生物类群,在土壤、植物和水环境中广泛存在[48-49]。另外,不同施肥模式也显著改变了属水平固氮微生物相对丰度(图3B)。如单施化肥或化肥配施羊粪或秸秆,会显著(P＜0.05)降低固氮弧菌属的相对丰度。前人研究表明,固氮弧菌属主要分为根系附生菌或内生菌和土传菌株两大生态类群[50],且该属与土壤有机碳、全氮、硝态氮、有效磷和速效钾含量显著负相关[17],这与本研究的结果一致(表3),说明固氮弧菌属可能更适合在贫营养的环境中生存。除此之外,单施化肥能够显著(P＜0.05)增加固氮螺菌属相对丰度,进一步分析发现这可能与单施化肥增加土壤C/N有关,因为固氮螺菌属相对丰度与土壤C/N显著正相关。固氮螺菌属碳、氮代谢途径广泛,使其在根际养分竞争中具有巨大优势[51]。上述结果意味着固氮螺菌属倾向于生长在高碳、低氮的环境中; 而单施羊粪则会显著降低脱氮单胞菌属相对丰度,增加慢生根瘤菌属和甲基杆菌属的相对丰度。低氮条件下生长的植物根内会富集脱氮单胞菌属物种[52],这也证实了我们的研究结果,即脱氮单胞菌属相对丰度与全氮和硝态氮显著负相关。单施羊粪处理土壤有机碳、全氮、硝态氮和速效钾含量显著增加,可能是导致慢生根瘤菌属相对丰度增加的原因(表1,表3)。但也有研究表明,慢生根瘤菌属与土壤有效磷和C/N显著相关[37]。尽管共生和非共生的慢生根瘤菌在土壤中普遍存在[19,53-54],但对调控慢生根瘤菌属丰度的关键环境因子还需进一步探究。甲基营养型微生物在不同环境中分布广泛,具有固氮、生产植物激素及溶磷、钾和锌等多种功能[55]。本研究也发现甲基细菌属与全碳、全氮、硝态氮、有效磷和速效钾显著正相关,而单施羊粪显著提高了上述土壤养分含量,这很好解释了单施羊粪显著增加甲基细菌属相对丰度的原因。

3.3 不同施肥模式对潜在固氮速率的影响

弄清不同施肥模式下土壤固氮速率对于预测人为活动和气候变化下的土壤氮循环十分重要。本研究中,不同施肥模式下青稞田土壤固氮速率为2.63～4.07 μg·kg-1·d-1,低于Liao等[19]测定的不同施肥模式下稻田土壤固氮速率14.6～118 μg·kg-1·d-1。这是由于尽管自生固氮微生物(专性厌氧菌、兼性厌氧菌或专性好氧菌)可在多种O2梯度的环境中进行固氮,但固氮酶对O2非常敏感,通常催化反应需要在厌氧条件下进行。因此,稻田的厌氧环境更有利于生物固氮[26]。施肥,尤其是增施有机肥(秸秆或羊粪)会显著降低青稞田土壤潜在固氮速率(图1),这与Fan等[18]对40年小麦(Triticum aestivumL.)-大豆(Glycine maxL.)轮作体系下不同施肥试验得出的结论一致。除此之外,我们还发现秸秆对土壤潜在固氮速率的抑制效应高于羊粪。通常认为,施肥通过增加外源氮的输入会抑制固氮微生物对大气氮的固定[56-57],因为固氮是一个十分消耗能量的过程,固氮微生物会优先利用外源氮进行自身的营养生长而非固定氮[3,58]。我们的研究结果也证实了这一观点,即铵态氮含量与潜在固氮速率显著(P＜0.05)负相关,且是调控潜在固氮速率最主要的环境因子(图2A和2C)。前人研究也表明,铵是生物固氮的直接产物,可通过调节nifA基因转录,在遗传水平上抑制固氮酶的合成[59],这意味着高浓度的铵可直接抑制固氮酶活性。但也有研究表明,化肥配施鸡粪可显著提高土壤固氮速率[19]。并且本研究中,虽然化肥配施秸秆模式下土壤铵态氮含量并未显著高于施用羊粪模式,但土壤潜在固氮速率却明显降低。这可能与不同有机物料质量不同有关,碳底物的质量和数量对于自生氮固定而言可能同样重要[60]。最近的Meta分析也表明,有机碳质量是驱动土壤生物固氮的关键因素,相比于较难分解的有机碳(纤维二糖和纤维素),易分解有机碳(葡萄糖)更有利于刺激微生物固氮,而难分解有机碳(单宁和草酸)对生物固氮作用没有显著促进作用[20]。研究表明,羊粪腐解速率高于秸秆[61],故其在腐解过程中能够快速释放易分解有机物质,进而快速刺激微生物固氮。因此,未来除关注不同施肥模式引起的土壤养分变化对自生氮固定带来的影响外,还需考虑自生氮固定对不同有机物料质量的响应。

4 结论

本研究揭示了短期(2年)不同施肥模式会显著影响青稞田土壤固氮微生物丰度、群落结构和潜在固氮速率。单施羊粪或化肥配施羊粪可显著提高固氮微生物丰度,而单施化肥或化肥配施秸秆则相反。施肥会降低土壤潜在固氮速率,增施有机肥(羊粪或秸秆)则明显加强了抑制效应。土壤理化性质中,全氮和铵态氮分别是显著影响和最佳解释固氮微生物丰度和潜在固氮速率的关键因子。施肥引起的土壤有效磷、pH和C/N变化,是调控固氮微生物群落结构变化的主要因子。不同施肥模式中,单施羊粪是提高青稞田土壤肥力,增加固氮微生物丰度,降低固氮速率下降的最佳施肥模式。另外,本研究中我们还发现,不同有机物料质量可能也会对自生固氮产生较大影响,因此下一步研究将着重考虑上述影响因素。