新疆部分地区猪口蹄疫病毒O型抗体检测与分析

常军帅，李 娜，王紫阳，屈勇刚，梁 晏，赵 玉，陈 宁

(1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.动物疾病防控兵团重点实验室，新疆 石河子 832003)

口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease virus, FMDV)引起的一种人兽共患烈性传染病。最早发生于1954年的意大利，随后在美国、墨西哥、加拿大及我国相继出现大规模暴发[1]。该病主要感染猪、牛、羊等偶蹄类动物，羊感染后不表现临床症状，但可长期向外排毒，病畜和隐性感染动物是FMDV的主要传染源。FMDV感染猪3 d后即可表现出临床症状，症状与猪痘、猪水疱病、渗出性皮炎相似，表现为口腔、蹄部、乳腺等地方出现水疱，体温升高至41 ℃，水疱破裂后开始糜烂，易继发细菌感染；严重病例可见成年猪蹄匣脱落，病猪卧地不愿行走。仔猪感染后表现为心肌炎，剖检可见“虎斑心”，少数病例表现为肠胃出血。FMDV包括7个血清型(A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型)，在我国以O型为主，A型时有发生。FMDV的传播方式分为弥漫扩散式和跳跃式两种，后者主要表现为FMDV可随风传播到60 km外的地方，通过空气感染健康猪群，为防治FMD增加了难度。正是由于FMDV对仔猪造成的死亡率高、增加了成年猪的料重比和传播迅速、无特效药治疗等特点，被动物卫生组织(Office International Des Epizooties, OIE)在《国际动物卫生法典》中列为必须上报的疾病，在我国称FMD为动物传染病之首，《家畜家禽防疫条例实施细则》中也明确规定其为一类传染病[2-3]。为了减少FMDV对我国肉类品牌出口的影响，2012年我国国务院办公厅印发了《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》，控制策略获得OIE认可[4]。

为减少FMDV对我国养猪业造成的经济影响，我国也在不断研发免疫效果和安全性能更好的疫苗，现在主要使用的为FMDV-O型灭活疫苗。疫苗质量、免疫程序、保存方式、给药途径及免疫抑制疾病等都可对免疫效果产生不良影响。ELISA(酶联免疫吸附试验)检测在评估猪FMDV疫苗免疫效果、调整免疫程序时价格低廉、方便快捷。本试验对2019—2020年采集的414份猪血清进行FMDV-O型抗体检测，根据结果对各猪场、各猪群进行免疫程序优化，以减少相关疾病的发生。

1 材料

1.1 样品

2019年1月至2020年12月期间从新疆石河子市、伊犁哈萨克自治州、阿克苏市、巴音郭楞蒙古自治州、奎屯市、塔城地区，按照地区、猪场及猪群类别的不同随机采集了414份血样，分离血清后立即在石河子大学动物科技学院进行检测。其中哺乳仔猪60份、保育猪76份、肥育猪45份、后备猪80份、繁殖母猪128份、种公猪25份。

1.2 材料和仪器

口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；37 ℃恒温培养箱购自上海东麓仪器设备有限公司；兽用一次性采血器5 mL为南昌市山力畜牧器械有限公司产品；移液器购自Eppendorf有限公司；自动酶标仪购自北京佳源兴业科技有限公司。

2 方法

2.1 样品及试剂准备

新鲜的、冷藏(2～8 ℃少于8 d)的、冰冻的血清都可用于检测；所有试剂需恢复至20 ℃，轻微震荡混匀。25倍PBST用蒸馏水稀释至1倍PBST；口蹄疫O型病毒抗原使用1倍PBST进行40倍稀释。

2.2 ELISA检测方法

用PBST稀释样品血清至1∶32和1∶64，阳性对照依次稀释至1∶2 048，阴性至1∶4稀释；取各孔50 μL稀释好的样品转至U型反应板上，每孔加入50 μL稀释好的病毒抗原，再设置4个100 μL的病毒抗原对照。封板后置于37 ℃恒温培养箱内放置1.5 h；各孔吸50 μL转至口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，37 ℃孵育1 h；经PBST洗5次拍干后，每孔加入50 μL口蹄疫O型豚鼠抗体工作液，封板后37 ℃温育30 min；再次洗涤，将TMB底物A和B以1∶1的比例混匀后，每孔加50 μL混合物，置于37 ℃显色15 min；加入50 μL终止液(1.25 mol/L硫酸)，立即测定OD450nm抗体数值。

2.3 认可标准

病毒抗原OD450nm应大于1.0，阳性对照效价应在(1∶1 024±1)滴度以内，阴性对照效价应＜1∶8。病毒抗原平均OD值50%计算(临界值)方式为：4个病毒抗原OD值中分别去除最高值和最低值，剩余数值之和除以4，即为临界值。

2.4 结果判定

样品抗体效价大于临界值判为阴性；小于或等于临界值判为阳性。

2.5 数据分析

使用SPSS软件对数据进行统计分析，计算各组数据的结果。

3 结果

3.1 临界值计算结果

通过进行3次重复试验，计算3次临界值(有效数据之和/4)平均数，结果为1.00。结果见表1。

表1 临界值计算结果

3.2 不同猪场FMDV-O型抗体检测结果

在414份样品中，81.88%(339/414)的血清有FMDV-O型的抗体存在，平均OD值为0.54。A～G猪场的阳性率分别为83.87%(52/62)、89.29%(50/56)、95.31%(61/64)、73.96%(71/96)、87.50%(42/48)、75.00%(36/48)、67.50%(27/40)；其中A场的平均OD值最高，为0.74，C场的平均OD值最低，为0.35；C猪场的平均OD值与A、D、F、G存在显著差异(P＜0.05)；B猪场的平均OD值与C、D、E、F、G场差异不显著(P＞0.05)。结果见表2。

表2 不同猪场FMDV-O抗体检测结果

3.3 不同类别猪群FMDV-O型抗体检测结果

各类别猪群中，哺乳仔猪、保育猪、肥育猪、后备猪、繁殖母猪、种公猪阳性率分别为76.67%(46/60)、64.47%(49/76)、77.78%(35/45)、85.00%(68/80)、92.19%(118/128)、92.00%(23/25)；其中保育猪的平均OD值最高，为0.79，繁殖母猪的平均OD值最低，为0.34；种公猪的平均OD值与哺乳仔猪、保育猪存在显著差异(P＜0.05)；肥育猪的平均OD值与后备猪、繁殖母猪差异显著(P＜0.05)。结果见表3。

表3 不同类别猪群FMDV-O型抗体检测结果

4 讨论与分析

FMD在我国不能彻底净化的原因主要有两个：一是极低量的FMDV(50万倍稀释后的水疱液1 mL的量)[1]便可导致健康猪发病，因此猪场只要有隐性感染和患病猪只的存在，就会威胁到整个场区的安全；二是该病毒可通过空气传播，并且猪场周围60 km内有猪、牛、羊等偶蹄类动物患病，就可随风传播，感染健康猪群。因此，定期评价疫苗免疫效果，才能更好保证种猪场健康生产。

检测结果得出，在414份样品中，81.88%(339/414)的血清有FMDV-O型的抗体存在，明显高于国家规定的70%，证明各地区对FMDV-O型的免疫效果良好[6]；席锐[7]曾于2011—2013年对新疆奇台县进行过FMDV-O型的抗体检测，合格率只有36.22%，与本次检测结果相差过大，推测其合格率低的原因为散养户免疫意识较差、技术落后等；史洪岩等[8]得出，北京密云地区规模化猪场猪FMDV-O型抗体阳性率为85.48%(265/310)，高于本次检测结果，但相差不大，说明目前我国各地对FMDV-O型免疫工作较以前更加重视。G猪场的阳性率只有67.50%(27/40)，低于国家标准，需加强免疫。各类别猪群中，繁殖母猪、种公猪阳性率较高，分别为92.19%(118/128)、92.00%(23/25)。FMDV-O型可存在精液、乳汁中，种猪群是猪场持续发展的基础，因此种猪群的免疫工作为重中之重[9]；保育猪的阳性率只有64.47%(49/76)，推测可能由于断奶造成的应激，导致免疫效果变差，可通过调整免疫时间，减少断奶应激、在饲粮中添加维生素C等方法进行改善。种公猪、后备猪、繁殖母猪的平均OD值与哺乳仔猪、保育猪存在显著差异(P＜0.05)，可针对后备猪进行加强免疫，为后备猪下一步的繁殖工作增强保障。

除疫苗防控外，在FMDV的预防工作中减少引种、定期消毒、科学饲养等工作也必不可少。不从疫区引种，引进种猪需隔离并进行3次FMDV抗原检测合格后才可合群；定期更换消毒剂，针对猪舍、饮水、人员、饲料、用具等严格消毒；使用全价料，注意微量元素的含量，减少猪群应激。只有全方位防控FMDV，才能保证人类健康和国际贸易的顺利进行。