肾性骨病方对5/6肾切除术后小鼠骨丢失影响的作用机制研究

张浩 王晶 周琳 赵东峰 赵永见 卫晓恩 王拥军 舒冰△

慢性肾功能不全患者常遭遇一系列骨骼疾病及血钙磷代谢紊乱，被称为肾性骨营养不良或肾性骨病。其中慢性肾脏疾病及骨矿物质代谢异常被称为慢性肾脏病矿化性骨病(CKD-MBD)。 在中低收入的慢性肾脏病患者中，肾性骨病的患病率高达30%。在这些患者中，几乎100%的晚期肾脏病患者都患有肾性骨病[1]。研究表明，慢性肾脏病早期即已出现了骨形成率的降低和低转换型骨代谢的表现[2-3]，这表明在肾功能不全早期就已经出现了骨代谢异常，如果能早期进行有效干预，则有可能延缓肾性骨病的发生发展。笔者分析了中医骨伤大家施杞教授治疗原发性骨质疏松症以及伴有慢性肾病患者的2 000多张中药处方，经过配伍网络分析、核心药物及药对发现等方法，形成了防治该病的肾性骨病基础方，并使用国际上经典的了肾性骨病动物模型—两阶段5/6肾切除模型，分别于早期(手术后1周)、晚期(手术后1个月)给予肾性骨病方干预并分析早期应用肾性骨病方治疗肾性骨病的疗效差异，为中医药治疗肾性骨病奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

所有动物实验均按上海中医药大学伦理委员会规定进行操作。选择3个月龄SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(Slac Laboratory，中国)，饲养温度为(23±1)℃，湿度为55%±5%，自由饮水、摄食。采用两阶段5/6肾脏切除的方法进行造模。予以腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)，待角膜反射消失、肌力下降后，俯卧位固定在手术台上，小鼠专用剃毛刀清除手术区域毛发，局部消毒后取后背正中旁开一指，肋骨下0.5 cm处纵行切口约0.5 cm，依次切开皮肤、皮下组织及肌肉组织，暴露左侧肾脏，剥离肾脏包膜，保护肾上腺，于肾脏中上及中下1/3处斜形切除上下肾极，压迫止血后，回纳左肾，逐层关闭伤口。1周后完整切除右侧肾脏；假手术组小鼠钝性剥除肾脏包膜后，不切除肾脏。

70只3个月龄C57BL/6J小鼠随机分为7组，每组10只，分为假手术组(0个月、1个月、2个月、3个月)和模型组(1个月、2个月、3个月)。模型组行5/6肾切除术后1、2、3个月取材，假手术组分别在假手术时、假手术后1个月、2个月、3个月取材。

80只3个月龄C57BL/6J小鼠随机分为8组，每组10只，分别为早期组(包括假手术组、模型组、肾性骨病方组和罗盖全组)和晚期组(包括假手术组、模型组、肾性骨病方组和罗盖全组)。早期组于术后1周开始给药，晚期组于术后1个月开始给药，各组均采用灌胃给药，1次/d，给药8周后取材。其中假手术组和模型组小鼠给予等量的生理盐水。

1.2 试验药物

肾性骨病方由淫羊藿12 g、补骨脂9 g、女贞子12 g，墨旱莲9 g，蛇床子12 g、枸杞子12 g、骨碎补15 g、桃仁12 g、鸡血藤12 g、海螵蛸12 g、三棱9 g、莪术9 g、熟地黄15 g、牛膝15 g、知母12 g、制大黄12 g组成。肾性骨病方中各药材及罗盖全胶丸( 0.25 μg×10粒/盒 ，罗氏制药)均购自上海中医药大学附属龙华医院。肾性骨病方采用传统方法煎煮2次后浓缩保存，罗盖全于生理盐水中制成混悬液备用。肾性骨病方浓缩煎剂和罗盖全混悬液的小鼠用量按照Meeh-Rubner氏公式，根据人与小鼠体表面积进行换算，等效剂量为0.186付(片)/kg/d。将每付中药煎成50 mL汤剂，每粒罗盖全配制成50 mL混悬液，按每只小鼠每次0.1 mL/10 g灌胃。

1.3 实验试剂及仪器

1.3.1实验试剂 兔IgG免疫组化试剂盒(SA1022)，武汉博士德生物工程有限公司；苏木素染液(D005)，南京建成科技有限公司；阿尔辛蓝染液(A5268-25G)，美国Sigma；橙黄 G(O3756-25G)，美国Sigma；萘酚AS-BI磷酸盐，美国Sigma；蔷薇苯胺，美国Sigma；马松染试剂盒(D026-1-1)，南京建成生物工程研究所；Rb mAb to beta catenin(ab32572，1∶500稀释)，Abcam；抗骨钙蛋白抗体(ab13420，1∶200稀释)，Abcam；抗Osterix抗体(ab22552，1∶200稀释)，Abcam；抗MMP9抗体(ab38898，1∶200稀释)，Abcam。

1.3.2主要试验仪器 徕卡轮转式石蜡切片机(RM2135)、徕卡摊片机(HI1210)、徕卡烘片机(HI1220)、徕卡组织脱水机(TP1020)、徕卡石蜡包埋机(EG1150 C+H)，德国Leica公司；Micro-CT仪(CT80)，瑞士Bassersdorf公司。

1.4 方法

1.4.1标本收集 腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉小鼠后，迅速摘除小鼠眼球并取血，全血室温静置30 min后，于4 ℃以3 500 r/min的速度离心10 min，收集血清，-80 ℃保存备用。颈椎脱位处死小鼠，取L5椎体放于10%中性福尔马林固定液24 h，随后流水冲洗2 h，放于75%酒精中备用。

1.4.2小鼠肾脏功能检测 采用双位点免疫放射测定法检测小鼠血尿氮(BUN)和血清肌酐(Scr)水平。具体操作按试剂盒说明书操作(Immutopics，Inc.，San Clemente，美国)。血清钙、磷总浓度分别采用邻甲酚他林络合物法和磷钼酸盐紫外比色法测定。

1.4.3Micro-CT扫描和三维重建 采用Micro-CT，以55 kV电压，72 μA电流，300 ms积分时间，10 μm横断面厚度及空间分辨率的参数扫描小鼠L5腰椎椎体，并以CT阈值参数250～1 000范围，重建三维结构和测量形态。采用μCT评估软件系统分析BV/TV结构参数，包括骨小梁的体积(BV)、样本总体积(TV)及二者比值骨体积分数(BV/TV)；骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)等骨小梁参数。

1.4.4小鼠腰椎骨组织形态学检测 小鼠腰椎Micro-CT扫描完成后，于10% EDTA(pH7.4)脱钙液中脱钙，每2 d换液，脱钙10 d后常规脱水浸蜡后石蜡包埋。腰椎石蜡标本进行4 μm冠状位连续切片，晾干后60 ℃烤箱过夜进行阿尔辛兰/橙黄G染色。切片常规脱蜡至水，在1%阿尔辛蓝染液中染色30 min，清水冲洗后分别在1%盐酸乙醇溶液中分化5 s，0.5%氨水中返蓝20 s。95%乙醇溶液放置1 min，0.05%橙黄G染液染色1 min。常规脱水透明后中性树脂封片，60 ℃烤箱过夜后，于普通光镜下观察，图像分析系统采片。

1.4.5免疫组织化学染色 小鼠腰椎石蜡切片常规脱蜡至水，放入3%H2O2甲醇溶液(1∶50稀释)中15 min消除内源性过氧化物酶；0.1%胰蛋白酶37 ℃消化10 min，5%胎牛血清(BSA)室温封闭1 h后加入一抗(anti-Osterix，ab22552，Abcam；anti-Cathpesin K，ab19027，Abcam)，4 ℃摇床孵育过夜，PBS清洗后，给予相应生物素化二抗室温孵育30 min；DAB溶液显色后依次苏木素复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，常规脱水透明后中性树胶封片。

1.4.6抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 小鼠腰椎石蜡切片常规脱蜡至水，将1.5 mL萘酚ASBI磷酸盐/乙二醇单乙醚溶液加入150 mL的Basic stock中，37 ℃孵育切片10 min；取3 mL的亚硝酸钠水溶液和3 mL副蔷薇苯胺/盐酸溶液混合，静置2 min后加入150 mL的Basic stock中，37 ℃孵育切片5 min。切片依次经苏木素复染、盐酸乙醇分化、氨水返蓝，常规脱水透明后中性树胶封片。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 5/6肾切除术后小鼠肾功能下降及骨丢失

为验证小鼠5/6肾切除模型的建立及药物干预时间，分别于5/6肾切除术后1、2、3个月收集小鼠血清检测CREA和BUN水平，并收集L5椎体检测骨密度变化。和假手术0个月组相比，5/6肾切除术后第1个月开始，小鼠血清CREA和BUN水平就出现明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；在手术第2个月和3个月时，血清CREA和BUN仍维持在显著高于假手术组的水平，差异有统计学意义(图1a-b，P<0.01)。与此一致的是，5/6肾切除术后第1个月开始，模型组小鼠腰椎BV/TV显著降低，并维持至手术3个月，差异有统计学意义(P<0.01，图1c-d)。这些结果表明，5/6肾切除1个月后，小鼠已经出现无法自行恢复的肾功能降低和骨量减少。骨小梁形态分析显示，Tb.N在术后1个月出现显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，变化早于Tb.Th和Tb.Sp，后两者从术后2个月时出现显著降低，这与文献报道的肾功能不全首先出现骨形成降低相吻合(图1e-f)。

图1 给与两阶段5/6肾脏切除后，假手术组和模型组小鼠肾脏功能及骨代谢指标变化(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.2 肾性骨病方早期干预改善5/6肾切除小鼠肾功能

和模型组相比，肾性骨病方早期干预后，5/6肾切除小鼠血清CREA和BUN水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而肾性骨病方晚期干预小鼠血清CREA和BUN水平没有明显变化。罗盖全无论早期干预或晚期干预，小鼠血清CREA和BUN均未见明显改善 (见图2)。

图2 早晚期应用肾性骨病方后，不同组小鼠肾脏功能(CREA/BUN)变化(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.3 肾性骨病方早期干预改善5/6肾切除小鼠骨丢失

与模型组相比，肾性骨病方和罗盖全早期干预后，5/6肾切除小鼠L5椎体BV/TV均显著增加(见图3a)，与肾性骨病方组比，差异有统计学意义(P<0.05)，与罗盖全组比，差异有统计学意义(P<0.01)。其中肾性骨病方可以显著提高小鼠L5腰椎Tb.N，差异有统计学意义(P<0.01)(见图3b)，降低Tb.Sp，差异有统计学意义(P<0.01)(见图3d)；罗盖全可以显著提高Tb.N和Tb.Th，降低Tb.Sp，差异有统计学意义(P<0.01)(见图3b-d)。肾性骨病方晚期干预则对BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp均无显著作用，罗盖全晚期干预可以提高5/6肾切除小鼠L5椎体BV/TV，差异有统计学意义(P<0.01)，增加Tb.Th，差异有统计学意义(P<0.01)，肾性骨病方对Tb.N和Tb.Sp亦没有显著作用(见图3e-h)。

图3 早晚期用药后，各组小鼠骨代谢指标(Micro-CT)结果(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

小鼠L5椎体重建(见图4a)及阿尔辛兰/橙黄G染色(见图4b)表明：肾性骨病方、罗盖全早期干预及罗盖全晚期干预，5/6肾切除小鼠L5椎体骨量及骨小梁微结构较模型组均有所提高。

图4 晚期用药后，不同组小鼠L5椎体Micro-CT重建结果及阿尔辛兰/橙黄G染色结果

2.4 肾性骨病方早期干预缓解5/6肾切除小鼠的骨形成下降，抑制破骨细胞数量

笔者进一步检测了小鼠L5椎体中成骨特异性指标Osterix、破骨细胞数量和特异性指标Cathpesin K的表达。

免疫组织化学染色显示，与假手术组相比，5/6肾切除小鼠L5椎体中Osterix表达显著降低，肾性骨病方及罗盖全早期干预后，Osterix表达明显升高。肾性骨病方晚期干预对Osterix蛋白表达无明显作用，而罗盖全晚期干预则仍可以提高Osterix的表达水平，差异有统计学意义(见图5，P<0.01)。

与之一致的是，肾性骨病方及罗盖全早期干预可以显著降低5/6肾切除小鼠L5椎体Cathpesin K表达。肾性骨病方晚期干预对Cathpesin K蛋白表达无明显作用，而罗盖全晚期干预则仍可以抑制Cathpesin K的表达，差异有统计学意义(见图5，P<0.01)。

图5 早晚期用药后，不同组小鼠L5椎体免疫组化蛋白表达-成骨相关蛋白Osterix/破骨相关蛋白表达Cathepsin K(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.5 TRAP染色显示

TRAP 染色结果显示，与模型组相比，肾性骨病方和罗盖全早期干预后，5/6肾切除小鼠L5椎体破骨细胞数量明显下降，其中早期给予罗盖全处理的小鼠椎体破骨细胞数量最少；晚期组中，罗盖全组较模型组有破骨细胞数量明显下降，其他各组均未见明显改变，差异有统计学意义(见图6，P<0.01)。

图6 早晚期用药后，不同组小鼠L5椎体TRAP染色结果(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

3 讨论

3.1 肾性骨病发病特点

慢性肾脏疾病(CKD)已成为当今全球范围的流行病，是非传染性疾病的一部分，严重影响着世界各国卫生保健和经济发展。研究指出在肾脏疾病的每个阶段即使是早期，CKD患者的骨折风险较正常患者也明显升高，这表明了CKD和骨质疏松以及骨质疏松性骨折之间的关系。其中，CKD-MBD合并有心血管疾病的患者临床死亡率极高[4-5]。然而，对于肾性骨病的研究多集中于肾功能不全晚期尿毒症阶段，而对于肾功能不全早期骨代谢的研究相对很少。实际上，肾功能不全早期就已经出现了骨代谢的异常，以骨形成减低为主，因此在肾功能不全早期开始防治肾性骨病可能会收到更好的疗效。

3.2 中医病因病机及治疗方法

肾性骨病可归于中医“骨痿”“虚劳”“骨范畴痹”等。一般认为肾性骨病的病机是各种先后天的病理因素致使肾气衰弱，造成慢性肾功能不全，精不生髓，骨失所养，即肾精衰退致骨骼退变[6]。

肾精亏虚是肾性骨病的重要病机，因此合理运用补肾填精壮骨方药对于改善肾性骨病有重要作用；由于肝肾同源、脾为后天之本，临床施治亦常采用健脾益肾、肝脾肾同治等法；此外肾性骨病是继发性骨病，在临床诊治时，需要兼顾患者原发病即慢性肾病的病理特点和肾功能状态，常综合运用补虚、化瘀、祛浊、解毒等法。临床报道中，淫羊藿、补骨脂、女贞子、墨旱莲、蛇床子等中药最长被用于骨质疏松的治疗[7-12]。这些中药的活性成分主要有淫羊藿苷、补骨脂素、女贞苷、特女贞苷，多项研究表明，这些活性成分具有显著的抗骨质疏松的作用。

实验表明淫羊藿苷能增加BMSC来源的成骨细胞数量，促进前成骨细胞的成熟，同时抑制原代成骨细胞的脂肪细胞转分化。淫羊藿苷体外介导成骨多种信号转导通路包括：BMP(骨形态形成蛋白)、NO(一氧化氮)、MAPK(增殖蛋白激酶)和Wnt/β-catenin途径[13-16]。淫羊藿苷还可通过抑制活性氧生成而发挥成骨作用；淫羊藿苷在人成骨细胞hFob1.19和小鼠成骨细胞MC3T3-E1中均可激活BMP-2/Smad4信号转导通路[17-18]。在MC3T3-E1细胞中，淫羊藿苷可以诱导ERK(细胞外信号调节激酶)和JNK (c-Jun-N末端激酶)的活化，但p38激酶活性不受影响[14]。另外阻断雌激素介导的信号转导可减弱淫羊藿苷诱导骨形成的作用。淫羊藿苷也能通过提升β-catenin mRNA表达，促进β-catenin亚细胞再分配，提高鼠BMSC GSK-3β(糖原合成酶激酶3)磷酸化水平[14]。补骨脂素处理的CD4+T细胞可显著促进RANKL诱导的RAW264.7向破骨细胞分化，而补骨脂素处理CD4+T可显著抑制RANKL诱导的RAW264.7破骨细胞的分化和骨吸收[19]。Li 等[20]用30只激素诱导骨质疏松模型的家兔，每天给予(6 g) 35 mg/kg补骨脂素提取物连续灌胃给药8周，与模型组相比，实验组的PPARγ明显减少，骨钙素的表达显著增加，实验证实补骨脂素能降低骨髓细胞的脂肪生成，促进钙沉积，预防骨质疏松。Dong等[21]发现，给予女贞子有效提取物女贞苷处理(700 mg/kg 灌胃) 12周可刺激卵巢切除术(OVX)大鼠肾脏1-25-羟化酶和维生素D受体(VDR)表达，增加循环水平1，25-(OH)2D3水平，进而改善OVX大鼠骨质疏松情况。应用蛇床子中的主要有效组分蛇床子素腹腔注射，可以有效缓解5/6肾切除小鼠的骨量减少，其主要机制与抑制5/6肾切除导致的破骨细胞形成增加有关[22]。而在体外研究中，NIU等发现蛇床子素可以提高成骨细胞BMP-2表达进而促进成骨分化[23]；Zhao等[24]研究发现，淫羊藿苷通过诱导Runx2表达激活BMP信号通路，在MC3T3-E1细胞和小鼠原代成骨细胞中发挥了强大的成骨作用；Zhang等[28]给予雌性OVX大鼠墨旱莲提取物 (1.4 g/kg灌胃) 12周后，给药组大鼠BMD以及血清降钙素(CT)明显高于对照组，胫骨mRANKL表达明显降低，但是对甲状旁腺激素无明显影响，这是其对OVX大鼠骨保护作用的部分原因。

肾性骨病方以淫羊藿、补骨脂、女贞子，墨旱莲，蛇床子等补肾中药为基础方，佐以制大黄，知母、牛膝清热解毒，利湿去浊；熟地黄、菟丝子，海螵蛸补肾填精；鸡血藤，桃仁、三棱、莪术活血祛瘀，通经去浊。全方以补肾填精益髓为法则，佐以利湿去浊，通调水道之法。本方剂为上海中医药大学附属龙华医院施杞教授治疗骨质疏伴慢性肾脏病患者的经验方，为临床治疗肾性骨病的经典方和有效方。

3.3 肾性骨病方治疗肾性骨病的机制

肾性骨病早期骨代谢呈低转换特点，主要表现为血清骨代谢指标降低；随着疾病的发展，由于机体代偿机制，中期骨代谢出现缓慢恢复，但此时肾脏就已经出现了不可逆的损伤；到了疾病晚期，肾脏失代偿，血清骨代谢指标变化同时还出现骨密度的显著降低，此期的骨代谢特点为高转换型[26-28]。因此笔者在小鼠慢性肾脏病早期就给予补肾填精益髓治疗，收到良好效果。结果证明在小鼠5/6肾脏切除术后早期应用肾性骨病方干预可有效降低小鼠血清肌酐及血清尿素氮(CREABUN)水平，而晚期应用肾性骨病方未观察到小鼠肾脏功能的明显变化。有趣的是笔者同时观察到早期应用肾性骨病方可以显著改善肾性骨病不鼠骨丢失情况。和模型组相比，早期用药后各组小鼠L5椎体BV/TV、 Tb.N值均显著升高，Tb.Sp下降，而晚期组只有罗盖全骨结构较模型组有明显改善。与之相一致的是：阿尔辛兰/橙黄G染色、L5椎体的三维重建。除此之外，笔者还发现早期应用肾性骨病方还可以促进成骨相关蛋白Osterix表达，抑制破骨相关蛋白Cathpesin K表达，TRAP破骨相关染色与之结果一致。

综上所述笔者得出结论，在早期应用肾性骨病方可以有效改善5/6肾脏切除后小鼠的肾脏功能，从而缓解因肾脏功能降低导致的继发性骨丢失。其对骨丢失的保护机制笔者推测：早期在肾脏功能尚具有代偿能力阶段给与肾性骨病方可以改善肾脏功能，延缓甚至改善继发性甲旁抗，调节体内钙磷平衡，促进肠道钙吸收，从而纠正骨丢失情况；其次肾性骨病方中大剂量的早期应用补肾中药可以直接作用于成骨/破骨细胞，抑制破骨细胞活性，降低破骨细胞数量并促进成骨细胞分化，从而改善肾性骨病继发骨丢失，相关进一步的机制，还有待于进一步研究。目前，临床对于肾性骨病往往收不到较满意的理临床疗效，本研究依据“肾主骨”理论，从肾论治，早期干预，在丰富“肾主骨”的科学理论内涵的基础上为肾性骨病的临床治疗提供更有效安全的中医治疗方法。