反刍动物重要经济性状相关环状RNA的研究进展

雷嫒嫒,仲 涛 (四川农业大学 畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，成都 6111300)

circRNA(circular RNA)于1976年在病毒中被首次发现[1]，3年后在动物细胞和真菌酵母中也发现了circRNA的存在[2]。随后在小鼠SRY基因、大鼠和人类细胞色素基因中也发现了circRNA[3-5]，但人们并没有认识到circRNA的重要性[6]。近年来，在越来越多的物种中均发现了circRNA，且来自不同物种的circRNA却有许多序列是同源序列。研究发现，circRNA不仅是剪接体介导的错误剪接的副产物，而且是通过顺式作用元件和反式作用因子调控反向剪接的产物，且circRNA的序列比线性RNA稳定[6]，另外还发现大多数circRNA的表达水平相比于其线性RNA表达要高[7]。迄今为止，研究人员已经在多种生物组织和细胞中发现至少有10%的基因能够产生circRNA[8]。

1 circRNA的特点及形成

circRNA由于其独特的闭合环状结构[8]和缺少可被RNA外切酶(包括RNase R)识别末端多聚腺苷酸A，与线性RNA相比更稳定，半衰期也更长[9]。circRNA在不同组织、不同时间和不同种属中有表达特异性，通常circRNA比线性RNA表达水平要低[10]，但在癌组织和癌细胞中，线性转录本的表达水平较高，可能与线性转录本容易被核酸外切酶识别磷酸二酯键，在癌细胞环境中易达到合成与降解的平衡相关[11]。

circRNA大多来源于已知的蛋白质编码基因，包含一个或多个外显子和内含子。根据来源及形成方式，可将circRNA分为三类：外显子环状RNA(Exonic circular RNA)、内含子环状RNA(Intronic circular RNA )、外显子和内含子环状RNA(Exonic-Intronic circular RNA,)[12-14]。来源于内含子的circRNA，主要存在于细胞核中，目前对其形成有两种假说，一是含有内含子的特殊结构，先形成闭合的套锁结构，再在相关脱支酶及核酸外切酶的共同作用下得到circRNA。另一种假说是前体tRNA的外显子两端的内含子碱基配对，之后环化的外显子被释放形成circRNA[15-16]。来源于外显子的circRNA大多存在于细胞质中，它是由前体mRNA经过特殊的背接法产生的[17]。外显子环化过程主要有两种机制：一种是直接的反式剪接，另一种是外显子跳读[18]。外显子环状RNA是在生物体内最丰富的环状RNA类型，外显子环化依赖于两侧的内含子互补序列。侧翼内含子之间或单个内含子内部的RNA配对之间的竞争可调节外显子环化效率，反向重复Alu对的交替形成和它们之间的竞争可以导致选择性的RNA环化，从而产生由单个基因产生的多个环状RNA转录本[19]。

2 circRNA的功能

2.1 circRNA可调控基因转录

circRNA可与转录因子结合调控基因转录。circRNA可以特异性结合某些蛋白，进而与RNA或DNA结合形成复合体，促进RNA结合蛋白(RBP)、RNA和DNA发生互作[20]。控制盲肌蛋白(muscleblind, MBL)合成的基因可经转录剪接形成circMbl，circMbl可与盲肌蛋白结合负反馈调节MBL的产生，即MBL可促进生成circMbl，同时促进Mbl mRNA的生成，而 circMbl会负反馈调节MBL。circMbl作为自我调节分子可抑制circMbl和Mbl mRNA的合成，从而抑制盲肌蛋白的形成[21]。

2.2 circRNA可与蛋白质相互作用

circRNA可与RBP结合后发挥其生物学功能。在AGO(Argonaute)蛋白参与的基因表达沉默机制中发现，circCDR1as和circSry能够通过结合AGO，并抑制AGO蛋白与靶标分子结合，影响mRNA翻译[24-25]。circANRIL可与pre-rRNA(rRNA前体)竞争性结合PES1蛋白，抑制PES1与核糖体结合，调控核糖体生成过程[26]。

2.3 circRNA可作为miRNA海绵

circRNA上存在大量miRNA结合位点，可作为内源性RNA与mRNA竞争miRNA，通过与miRNA结合发挥海绵作用，调控靶基因的表达[27]。科学家在糖尿病视网膜病变患者和糖尿病大鼠中都发现circDNMT3B在视网膜内皮细胞中的表达下调，circDNMT3B可海绵吸附miR-20b-5p，负调控miR-20b-5p在糖尿病视网膜血管内皮细胞中的表达，减轻视力损害[28]； circFUT10对miR-133a发挥海绵作用，通过直接与miR-133a结合并抑制miR-133a的活性来调节牛成肌细胞的分化和细胞存活[29]；在肝癌细胞中，circMTO1可发挥海绵功能吸附miR-9，抑制mRNA的表达，进而调控癌细胞的生长[27]；circZFR通过海绵作用结合miR-130a和miR-107抑制胃癌细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞，促进其凋亡[31]。

2.4 circRNA可翻译功能蛋白质

目前，circRNA翻译机制有两种：一种是依赖内部核糖体嵌入位点(IRES)；另一种是依赖N6-甲基腺苷甲基化修饰。这两种翻译过程，往往是在细胞应激状况下被激活，从而使得特定基因启动表达。如circβ-catenin由 IRES 驱动翻译 β-catenin-370aa 蛋白，影响肝癌细胞的生长过程[32]，circPINT由IRES介导，翻译得到PINT-87aa蛋白，抑制恶性胶质瘤细胞的增殖[33]。同时部分circRNA虽然没有IRES，仍能结合核糖体启动翻译。如在人的癌细胞中circE7由m6A介导，可编码E7的蛋白，促进宫颈癌细胞的增殖[35]，另外，小鼠的成肌细胞circZNF609，因具有开放阅读框，可翻译蛋白质[35]。

2.5 circRNA可参与细胞通讯和信号转导

在动物体的外泌体、血清等中circRNA的含量和种类都有显著差异，推测circRNA可能参与细胞物质和信息的传递交流[36]。由于circRNA对核酸外切酶有较强抵抗性且具有高稳定性，判断在机体内可能会有circRNA积累。这种积累是否有毒目前尚不清楚，可能存在调控circRNA含量的分子机制，如降解或驱逐circRNA的分子机制，包括其他囊泡转运机制或内切酶的裂解等。有研究发现，分泌小泡(外泌体)中的circRNA含量与线性RNA相比较多，表明circRNA通过囊泡将信息传递给其他细胞，达到对细胞内circRNA水平的控制[37]。

3 circRNA在反刍动物的研究进展

已有的circRNA研究主要集中在疾病方面。例如，circRNA可作为膀胱癌[38]、结肠癌[39]和肺癌等[40]癌症中的诊断标记之一。但在动物方面，circRNA的研究较少，在反刍动物中已有的研究主要集中在生长发育等方面。

3.1 circRNA对反刍动物繁殖性状的影响

3.1.1 circRNA对山羊卵细胞的调控 研究发现，麻城黑山羊产羔数比西方山羊品种多，可能与排卵率较高有关[41]。因此，Tao等[42]分别采集了麻城黑山羊和波尔山羊的排卵前卵泡，利用RNA测序技术检测两品种卵泡中circRNA的表达情况。在两个山羊品种中发现37个差异表达circRNAs，其中chi_circ0008219可以通过海绵作用招募3个卵泡相关miRNAs(chi-miR-34c-5p、chi-miR-483、chi-miR-1468-3p)。有研究已证实，miR-34c通过与Bc1-2相互作用，参与并调控第一次胚胎分裂[43]；miR-483作为一种卵巢miRNA，在伴有排卵功能障碍的女性中会表达失调[44]；chi-miR-1468在山羊卵泡期和黄体期中存在差异表达[45]，推测circRNA可能通过与调控靶基因表达的miRNA结合来调控卵泡发育。

卵泡颗粒细胞对卵泡的生长和卵母细胞的成熟有着重要作用，陶虎等[46]构建了山羊新环状RNA circ_ZCCHC24的过表达载体pc-circ_ZCCHC24，研究其对山羊卵泡颗粒细胞增殖的调控作用，发现过表达circ_ZCCHC24后，细胞中circ_ZCCHC24的mRNA表达量升高了41.3倍(P<0.01)，山羊卵泡颗粒细胞增殖速率也有了较大提高，表明circ_ZCCHC24过表达可促进颗粒细胞增殖。这些研究揭示了可以通过调控circRNA的表达，影响山羊卵泡的发育，提高山羊的繁殖性能。

3.1.2 circRNA对奶山羊子宫内膜的影响 胚泡在子宫内的着床能力用子宫内膜容受性(receptive endometrium，RE)表示，RE与糖蛋白、细胞因子和甾类激素的调控等因素有关。最近的研究表明，非编码RNA在RE的形成中起着重要的作用，Song等[47]在山羊子宫内膜胚胎着床(receptive，R)期和胚胎着床前(pre-receptive，P)期，进行miRNA的表达检测分析，研究结果显示，有442个miRNA在R期和P期中均有表达，且表达差异明显。表明，miRNA在子宫内膜的发育的不同阶段表达情况不同。之后，Song等[48]探究了circRNA在山羊子宫内膜中的表达情况，发现R期与P期相比有334个有显著差异表达的circRNA，并对circRNA-miRNA相互作用网络的进行分析，分析结果支持circRNA作为miRNA海绵调节基因表达的观点，也进一步表明了circRNA可能发挥了海绵作用影响了山羊子宫内膜的基因表达。

circRNA功能与其宿主基因密切相关，circRNA8077的宿主基因CRIM1在激活妊娠早期重要的血管内皮生长因子和细胞外基质的表达中起重要作用[49]。CRIM1是circRNA8072的宿主基因，circRNA8072在妊娠早期表达量显著上调，推测circRNA8072的表达可能对奶山羊子宫内膜的容受性产生影响。

子宫内膜的发育与胚胎附植密切相关，miRNA和circRNA 可在山羊子宫内膜组织中表达，调控其生长。miR-26a可促进奶山羊子宫内膜上皮细胞增殖，而circRNA3669可在奶山羊P期子宫内膜组织中特异性表达，作为竞争性RNA吸附miR-26a，并抑制miR-26a的活性，调控子宫内膜上皮细胞的生长[50]；circRNA8073可发挥海绵作用于miR-449a，促进子宫内膜上皮细胞增殖[51]；一些circRNA在子宫内膜上皮细胞和子宫内膜基质细胞中被性腺激素(如：E2和P4)调控[48]。这些研究结果揭示了circRNA在山羊子宫内膜的生长发育中发挥的作用，为探索反刍动物繁殖性能提供了新的方向。

3.1.3 circRNA影响乳腺组织的表达 奶牛乳腺炎的发生与遗传、环境等因素有关。王兵兵等[52]发现环状RNA circLPP参与奶牛乳腺炎的发生发展过程。circLPP通过吸附miR-615，影响其靶基因SPRED3 mRNA的表达，调控奶牛乳腺细胞的增殖，影响奶牛乳腺炎的发展过程。

Hao等[53]利用小尾寒羊和甘肃高山细毛羊探究在泌乳高峰期circRNA在乳腺组织的表达谱，得到有部分circRNA与乳腺细胞的发育和哺乳有关，例如miR-200家族在妊娠和哺乳期间表达，预测circ-001091可靶向调控miR-200b。此外，还发现circ-001091具有miR-29b的靶点，从而抑制miR-29可以减少奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白、甘油三酯和乳糖的分泌[54]。Liu等[55]研究发现，miR-574-5p对乳腺发育和泌乳性能有显著影响，miR-574-5p的过表达可提高山羊乳腺上皮细胞的凋亡，降低细胞的增殖，而抑制miR-574-5p的表达则呈现相反的结果，进一步探讨miR-574-5p在山羊乳腺上皮细胞中作用的分子机制发现，miR-574-5p通过抑制山羊乳腺上皮细胞中PI3K/AKT mTOR通路的MAP3K9和AKT3的激活来抑制牛奶合成，circ-016910发挥海绵作用吸附miR-574-5p，可促进羊奶的合成。以上研究表明，circRNA通过发挥海绵作用吸附miRNA影响miRNA对应的mRNA的表达，调控乳腺细胞的发育，影响反刍动物乳腺组织的生长。

3.2 circRNA对反刍动物生长发育的影响

3.2.1 circRNA对绵羊内分泌的影响 垂体前叶是调节动物出生后生长最重要的内分泌器官，主要调控生长激素(GH)的基因转录、合成和分泌。Ye等[56]将巴马小型猪和大型猪长白猪作为研究动物产后生长的理想模型对它们的垂体前叶进行miRNA和mRNA表达谱分析，研究发现了222个miRNA，其中一些可能影响动物出生后生长，推测垂体中的非编码RNA参与了出生后垂体的生长，circRNA作为胚胎垂体发育和内分泌调节的新型调控因子，通过作用于miRNA影响转录后调控。Brinkmeier等[57]研究发现，与某些关键通路相关的157个基因在小鼠发育中的前腺中表达。基于以上研究成果，研究人员在羊上开始进行垂体基因的相似研究，利用miRanda和psRobot在绵羊circRNA中识别了miRNA靶点，丰富的KEGG和GO通路清楚地表明circRNA在垂体和激素分泌的基本生物学调控中发挥重要作用，特别是甲状腺激素信号通路、GnRH信号通路、磷脂酰肌醇信号通路。Li等[58]研究发现circRNA在绵羊发情和非发情期间在垂体腺中的表达模式存在大量差异，在绵羊妊娠期和产后两个时期circRNA在垂体中表达存在差异[59]，进而发现circRNA参与了与垂体功能相关的信号通路，这些结果进一步证实了circRNA可以在绵羊脑垂体中表达发挥作用，另外circRNA在绵羊的垂体中表达的量比骨骼肌和脂肪生成中的表达要高[60]，circRNA在绵羊脑垂体中大量表达进一步表明了circRNA对反刍动物的生长有着重要作用。

3.2.2 circRNA对山羊与牛骨骼肌的影响 在肌肉生长过程中起重要作用的肌细胞增强因子2C(MEF2C)可以产生circRNA468，肌细胞增强因子2A(MEF2A)可以产生circRNA235。现已发现circRNA和许多与肌肉生长发育相关的miRNA相互作用影响肌肉生长发育，如miR-208、miR-133和miR-206[61]。此外，一些circRNA同时包含两个不同miRNA的靶点，例如，circRNA30同时具有miR-29和miR-26位点，miR-29可以和Akt3靶向结合，抑制Akt3对成肌细胞增殖的作用，促进Akt3对成肌细胞分化的作用[61]。

Cao等[62]在绵羊骨骼肌中鉴定了大量circRNA，并通过RT-PCR对测序数据进行了验证。在KEGG通路分析中发现，有几种circRNA如circRNA30、circRNA100、circRNA468、circRNA678、circRNA205和circRNA606参与了肌肉的发育和生长过程。功能预测表明circRNA在绵羊骨骼肌的生长发育过程中起着重要作用。魏雪锋[63]在以秦川牛为材料研究中，得到miR-378a-3p可与HDAC4靶向结合，抑制牛骨骼肌细胞增殖，促进肌细胞的分化和凋亡。circ LMO7 与HDAC4竞争性结合miR-378a-3p，调控牛骨骼肌的生长发育。这些研究结果证实了circRNA在反刍动物的骨骼肌中大量表达，调控反刍动物骨骼肌的生长发育。

4 结 语

随着对circRNA的研究深入，越来越多circRNA的作用被发现，例如，在人类的多种肿瘤癌症等疾病中circRNA可充当标志分子，但在动物生长发育中的研究较少，目前在反刍动物中发现，circRNA在反刍动物繁殖与生长发育的遗传调控机制中发挥作用，因此，应加快对circRNA作用的挖掘与发现，为反刍动物经济性状的提高提供帮助，为反刍动物的遗传改良奠定基础。