山慈菇对肝癌细胞凋亡和上皮间质转化的影响*

程清波，杨艳萍，王滢，程文涛，张晋芬，张小莉

1.应城市人民医院，湖北 应城 432400；2.武汉科技大学附属医院，湖北 武汉 430000

肝癌是临床常见的恶性肿瘤疾病，在我国的死亡率高居恶性肿瘤第二位，而每年新发病例数量占全球50%以上，且发病率呈逐年上升趋势，已成为我国重大公共健康问题［1-2］。随着医疗技术的发展，手术、放化疗、靶点治疗等手段不断提高，肝癌得到一定程度的控制，但总体疗效仍不理想［3］。近年来，中医药在肿瘤治疗中的应用受到越来越多的重视。中医认为，肿瘤属于“积聚”的范畴，《难经》中记载：“肝之积为肥气，在左胁下，如覆杯”［4］，其中肝积、肥气等描述与肝癌相似。山慈菇是兰科植物杜鹃兰和独蒜兰的假球茎，具有清热解毒、消痈散结之功效［5-6］。研究显示，山慈菇在乳腺癌、肝癌、胃癌等癌症中表现出抗肿瘤作用，可明显抑制新生毛细血管的生成［7-9］。现今山慈菇与肝癌的研究大多集中于杜鹃兰的单体成分，而有关含药血清的药理研究较少。基于此，本研究考察山慈菇含药血清（Pseudobulbus Cremastrae seu Pleiones pharmaceutic serum，PCPS）对肝癌细胞HepG2生长运动、凋亡及间质转化的影响，为山慈菇对肝癌的临床治疗提供实验基础。

1 材料

1.1 实验细胞与动物动物：40只健康SD大鼠，雌性，2月龄，体质量180～220 g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号：SYXK（京）2019-0030。大鼠正常摄食饮水，12 h/12 h昼夜交替，室内温度22～25℃，湿度40～60%。

细胞：人肝癌细胞HepG2（上海恒斐生物科技有限公司，货号：SCC-110211）。

1.2 药物与试剂山慈菇购自亿弘堂药业有限公司。Annexin V-FITC/PI双染试剂盒（弗元生物科技有限公司，货号：FY600016-20T）；二甲基亚砜（上海联硕生物科技有限公司，货号：0231）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK8）、EdU细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物，货号：C0071S、C0038）；细胞固定液、甘氨酸（浙江联硕生物科技有限公司，货号：E703-1L、0167）；戊巴比妥钠、渗透剂（化源网，货号：57-33-0、1639-66-3）；上皮钙黏素（E-cadherin）抗体、波形蛋白（Vimentin）抗体、p27抗体、Survivin抗体、神经钙黏素（N-cadherin）抗体和GAPDH抗体（圣克鲁斯生物技术公司，货号：sc-21791、sc-373717、sc-1641、sc-17779、sc-8424、sc-51332）；HRP标记的山羊抗兔二抗（武汉艾美捷科技有限公司，货号：4030-05）；DMEM高糖培养基（Worldrm生物商城，货号：D6046）；RPMI-1640培养基、胎牛血清（郑州九龙生物制品有限公司，货号：BC-B-021、JLAQ-110）；RIPA裂解液（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号：PC101）；蛋白定量试剂盒、结晶紫指示剂、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（上海源叶生物公司，货号：R21252-500T、R22103、25535-16-4）；75%乙醇（南京化学试剂股份有限公司，货号：64-17-5）。

1.3 仪器Transwell小室（北京明阳科华生物科技有限公司，货号：BD-353502）；人工基底膜（北京盈丰大通科技有限公司，货号：354234）；Being BPN-RHP型CO2培养箱（武汉集思仪器设备有限公司）；MA-6000型荧光定量PCR仪（济南千司生物技术有限公司）；FrontierTM5000型离心机（美国奥豪斯公司）；BDF-25V270型低温冰箱（山东博科科学仪器有限公司）；BXF-80型倒置显微镜（上海炳宇光学仪器有限公司）；EPS-300型电泳仪（上海巴玖实业有限公司）；JS-680D型凝胶成像仪（杭州得聚仪器设备公司）；1703940型半干电转膜仪（美国伯乐公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）；XSP-63B型荧光显微镜（上海光学仪器公司）；DNM-9606型酶标仪（南京普朗医用设备有限公司）；ZHBF-RE型旋转蒸发仪（北京中环北方环保科技有限公司）。

2 方法

2.1 山慈菇浓煎液的制备准确称取100 g山慈菇，将其粉碎后，置于去离子水中浸泡2 h，通过水煎法制备山慈菇提取液，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至浓度为1 kg·L-1，即为山慈茹浓煎液［10］。

2.2 PCPS的制备将40只雌性SD大鼠随机分为空白组和山慈菇低、中、高剂量组，每组10只，山慈菇低、中、高剂量组分别以5 mL·kg-1、10mL·kg-1、20mL·kg-1的剂量灌胃给予1 kg·L-1山慈菇浓煎剂，每天1次，连续6 d，空白组给予生理盐水。末次给药2 h后，以1 mL·kg-1的剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采血，静置2 h，2 000 r·min-1离心15 min，离心半径20 cm，分离上层血清，置于56℃水浴30 min，过滤除菌，置于-20℃备用［11］。

2.3 细胞培养肝癌细胞HepG2为贴壁细胞，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬细胞，当细胞生长至80%时，进行消化传代培养，选取对数生长期的细胞用于实验检测。

2.4 细胞形态观察将HepG2细胞以1×106mL-1接种于6孔板，待细胞贴壁后分别添加空白组、山慈菇低剂量组、山慈菇中剂量组、山慈菇高剂量组大鼠的含药血清，培养24 h，光镜下观察细胞的形态学变化。

2.5 CCK8法检测HepG2细胞活力将HepG2细胞以1×105mL-1接种于96孔板，待细胞贴壁后分别添加空白组、山慈菇低剂量组、山慈菇中剂量组、山慈菇高剂量组大鼠的含药血清，培养24 h、48 h、72 h及96 h后，加入含有10μL CCK8的培养基，继续培养1～4 h（待培养基颜色变为橙色），于450 nm波长下检测各孔吸光度。

2.6 EdU染色检测HepG2细胞增殖将HepG2细胞以1×106mL-1接种于6孔板，待细胞贴壁后分别添加空白组、山慈菇低剂量组、山慈菇中剂量组、山慈菇高剂量组大鼠的含药血清，培养24 h，再加入50μmol·L-1EdU培养基100μL，继续培养2 h，分别加入细胞固定液、甘氨酸、渗透剂进行细胞固化，Apollo染色和DNA染色后，于荧光显微镜下观察并计数粉色荧光细胞（即为增殖细胞）。

2.7 流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡将HepG2细胞以5×104mL-1接种于25 cm2培养瓶中，待细胞贴壁后分别添加空白组、山慈菇低剂量组、山慈菇中剂量组、山慈菇高剂量组大鼠的含药血清，培养48 h，收集细胞，加入预冷的75%乙醇，4℃固定过夜，再分别加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育20 min，加入结合缓冲液，1 h内上流式细胞仪进行检测。

2.8 Transwell小室实验检测HepG2细胞侵袭以Matrigel基质胶包被Transwell小室底膜的上室面，置于六孔板，将HepG2细胞以1×106mL-1接种于Transwell小室上室，下室添加含有20%胎牛血清的培养基，待细胞贴壁后分别添加空白组、山慈菇低剂量组、山慈菇中剂量组、山慈菇高剂量组大鼠的含药血清，培养24h，拭去基质胶和上室内细胞，75%预冷酒精固定30 min后，以0.1%结晶紫染色5～10 min，光镜下拍照并计数。

2.9 蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达将HepG2细胞以1×106mL-1接种于6孔板，待细胞贴壁后分别添加空白组、山慈菇低剂量组、山慈菇中剂量组、山慈菇高剂量组大鼠的含药血清，培养24 h后，添加RIPA裂解液提取总蛋白，采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中细胞周期抑制因子p27、凋亡抑制因子Survivin及上皮间质转化标记物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达，以GAPDH为内参，计算各目的蛋白的相对表达量。

2.10 统计学方法采取统计学软件SPSS 17.0分析处理，数据以平均值±标准差（±s）表示，本文所有实验进行3次平行实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 PCPS对HepG2细胞形态的影响光镜下观察显示，空白组细胞为椭圆形或短梭形，有短伪足；PCPS处理后细胞伪足减少，且20 mL·kg-1PCPS组细胞体积明显增大。见图1。

图1 PCPS对HepG2细胞形态的影响（×200）

3.2 PCPS对HepG2细胞活力的影响与空白组比较，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS处理后，细胞活力明显降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS处理后细胞活力无明显变化。见图2。

图2 PCPS对HepG2细胞活力的影响

3.3 PCPS对HepG2细胞增殖的影响与空白组比较，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS组细胞增殖率明显降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS组细胞增殖率无明显变化。见图3。

3.4 PCPS对HepG2细胞凋亡的影响与空白组比较，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS组细胞凋亡率无明显变化。见图4。

图4 PCPS对HepG2细胞凋亡的影响

3.5 PCPS对HepG2细胞侵袭的影响与空白组比较，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS组细胞侵袭率明显降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS组细胞侵袭率无明显变化。见图5。

图5 PCPS对HepG2细胞侵袭的影响

3.6 PCPS对HepG2细胞p27和Survivin蛋白表达的影响与空白组比较，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS组细胞中p27蛋白表达水平显著上调（P＜0.05），Survivin蛋白表达水平显著下调（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS组细胞中p27和Survivin蛋白表达水平无明显变化。见图6。

图6 PCPS对HepG2细胞p27和Survivin蛋白表达的影响

3.7 PCPS对HepG2细胞中上皮间质转化蛋白表达的影响与空白组比较，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS组细胞中E-cadherin蛋白的表达水平显著上调（P＜0.05），而N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平显著下调（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS组上述蛋白表达水平无明显变化。见图7。

图7 PCPS对HepG2细胞中上皮间质转化蛋白表达的影响

4 讨论

由于对肿瘤的认识不足，多数肝癌患者确诊时已进入中晚期，错失治疗的最佳时期，临床治疗时常加大化疗剂量，控制肝癌细胞，但其毒副作用也非常明显［12］。同时，长期化疗可导致肿瘤细胞产生耐药，使治疗效果不佳［13］。因此，寻求安全、有效的治疗药物，一直是医学界的研究热点。随着各类肿瘤细胞和肿瘤动物模型研究的日益成熟，中药以其疗效肯定，药性温和，持续时间长的特点，在肿瘤康复治疗中展现出独特的优势［14-15］。龚正等［16］观察不同中药复方联合盐酸埃克替尼治疗晚期非小细胞肺癌疗效发现，艾愈胶囊（山慈菇、白英、当归等）或复方斑蝥胶囊（斑蝥、人参、黄芪等）联合盐酸埃克替尼的疗效均优于单用盐酸埃克替尼，且不增加药物的副作用。山慈菇是兰科植物杜鹃兰和独蒜兰的假球茎，在临床上多以复方入药，用于肿瘤的治疗。现代药理研究显示，山慈菇提取的单体成分具有抗肿瘤作用，可通过细胞毒作用抑制肿瘤细胞增殖与侵袭转移、抑制新生血管生成、诱导其凋亡及免疫调节等［17］。Liu等［18］从杜鹃兰醇提物中分离的双菲类化合物对乳腺癌细胞BT474和SKBR3有明显的细胞毒性。姜爽等［19］观察到山慈菇多糖对小鼠骨肉瘤细胞S180具有明显的抑瘤作用，可能与提高机体免疫力有关。中药药理研究中，含药血清药理研究也是一种体外实验法，可明显克服粗体物体外实验的干扰，更为接近中药在体内环境中产生药理效应的真实过程［20］。陈思等［21］通过体外实验发现，PCPS可有效抑制人乳腺癌细胞SK-BR-3的活性，加速细胞凋亡，并抑制其迁移能力。以上实验充分肯定了山慈茹的抗肿瘤活性，但PCPS在肝癌中的抗肿瘤作用及其机制尚不完全清楚，因此，本研究通过体外实验探究PCPS对肝癌细胞恶性生物学特征的影响及相关作用机制。

癌细胞生长、增殖、侵袭是肿瘤恶化的特征。本研究通过CCK8和EdU染色实验发现，PCPS干预肝癌细胞后，可明显抑制细胞的生长和增殖能力。p27蛋白是细胞周期负向调控因子的主要成员，主要对外部促进或抑制细胞增殖的信号起反应［22］。蛋白免疫印迹结果显示，经PCPS处理后肝癌细胞中p27蛋白表达水平显著上调，提示PCPS抑制肝癌HepG2细胞增殖可能与p27的激活有关。此外，在Transwell小室实验中也发现，PCPS可显著抑制肝癌细胞的侵袭能力。而癌细胞的侵袭、转移与上皮间质转化（epithe-lialmesenchyml transition，EMT）密切相关［23］。Ecadherin为上皮标志蛋白，Vimentin和N-cadherin为间叶标志蛋白，它们在细胞黏附、迁移等方面发挥重要作用［24］，其中，Ecadherin下调、Vimentin和Fibronectin上调被认为是EMT发生的重要标志［25-26］。在本研究中，经PCPS处理后，肝癌细胞中E-cadherin蛋白表达水平显著上调，而N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平显著下调，提示PCPS可能通过调控上皮间质转化，抑制HepG2细胞的侵袭能力。

凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，能有序和有效地去除受损细胞，与很多疾病的发病机制密切相关，包括癌症［27-28］。在本研究中，通过凋亡实验发现，PCPS处理HepG2细胞48 h后，细胞凋亡率明显升高。Survivin蛋白作为重要的凋亡抑制因子，可直接抑制凋亡终末效应酶活性，阻断细胞凋亡过程，还可与周期蛋白激酶相互作用阻滞凋亡信号通路［29］。蛋白免疫印迹发现，经PCPS处理后，HepG2细胞中Survivin蛋白表达水平明显下调，提示PCPS可能通过下调Survivin蛋白的表达，从而诱导HepG2细胞的凋亡。此外，细胞伪足可促进细胞迁移、运动，伪足减少，贴壁生长的细胞会变圆脱落，从而促进细胞凋亡［30］。本研究通过光镜下观察各组细胞的形态发现，经PCPS处理的HepG2细胞伪足减少，细胞明显增大。细胞体积逐渐增大，会使细胞肿胀破裂，导致凋亡。以上结果再次提示，PCPS可以促进肝癌细胞的凋亡。另外，本研究实验中以10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS组效果更为显著，提示山慈菇的临床应用中需要注意其剂量，以保证其更好地发挥抗肿瘤作用。

综上所述，PCPS可有效抑制HepG2细胞的增殖、侵袭能力，诱导凋亡，抑制其上皮间质转化。