牛膝多糖调控Wnt/β-catenin通路改善骨质疏松性骨折大鼠骨代谢的研究*

杨豪，曾范慧

驻马店市中心医院，河南 驻马店 463400

骨质疏松是由于骨量低、骨微结构遭破坏而引发的全身性骨骼疾病。老年人群较为常见，绝经后的女性发病率也较高［1］。随着老龄化日益加重，骨质疏松患者发病率也逐年上升［2］。有文献报道，仅骨质疏松所致髋部骨折患者中1年内因并发症致死率约20%，50%左右患者致残，严重影响患者的生活［3］。目前增强骨质的常见药物有雌激素、降钙素、生长激素等，但是长期使用药物引起的不良反应不容忽视［4］。牛膝具有补肝肾、强筋骨、活血化瘀的功效［5］。牛膝多糖为牛膝的主要成分之一。研究表明，牛膝多糖可促进关节软骨细胞增殖，可应用于骨性关节炎［6］。Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路在骨发育、分化及修复等过程中具有重要调节作用。研究发现，激活Wnt/β-catenin通路可以调节骨代谢，促进骨折愈合［7］。本研究基于Wnt/βcatenin通路探讨牛膝多糖对骨质疏松骨折大鼠骨代谢的调控作用，为临床治疗骨质疏松骨折提供依据。

1 材料

1.1 动物清洁级SD雌鼠60只，体质量270～290 g，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证号：SCXK（沪）2019-0001。饲养条件：12 h光照12 h黑暗，温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，自由饮食和进水。伦理批号：ZMDCH201902-03。

1.2 药物与试剂牛膝多糖（纯度≥98%，兰州沃特莱斯生物科技有限公司，批号：130415）；尼尔雌醇（安徽圣鹰药业有限公司，批号：190412）。生理盐水（辽宁民康制药有限公司，批号：20181204）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，批号：180316、180520）；细胞裂解液（上海李记生物科技有限公司，批号：20180416003）；制胶试剂盒（北京德元国际科技有限公司，批号：20180912A）；电化学发光（electrochemi luminescence，ECL）试剂盒（上海炎熙生物科技有限公司，批号：181114C）；实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）预混体系（SYBR GreenⅠ）（上海联迈生物工程有限公司，货号：RT0416135208）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（bone gla protein，BGP）、Ⅰ型前胶原氨基端前肽（type Iprocollagen propeptide，PINP）、Ⅰ型胶原蛋白交联N端端肽（N-terminal typeⅠcollagen telopeptide，NTx）酶联免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司，批号：190106、190225、190218、190316）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatage，TRAP）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：20181013007）；苏木精-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：1805A）；引物合成委托苏州金唯智生物科技有限公司；β-catenin、RUNT相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨形成转录因子（Osterix）、磷酸化β-连环蛋白（phosphorylationβ-catenin，p-β-catenin）、β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）二 抗（美 国Abcam公 司，批 号：180611、180425、180326、180107、180922、180715）；蛋白定量试剂盒（美国Sigma公司，批号：1904112）。

1.3 仪器HBS-1096A型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；HHQ-3558型组织切片机（杭州艾普仪器设备有限公司）；BK-T型摊烤片机（山东博科生物产业有限公司）；BX53M型光学显微镜（日本Olympus公司）；Mini-PROTEAN Tetra型电泳槽和Trans-Blot Turbo型蛋白转印系统（美国Bio-Rad公司）；AriaDNA型RT-qPCR仪（加拿大鲁美科思公司）；UltraFocus型双能X射线小动物骨密度仪（美国Faxitron公司）。

2 方法

2.1 动物模型的复制与给药从60只大鼠中随机挑出50只进行去卵巢骨质疏松大鼠模型的制备，打开大鼠腹腔，切除大鼠两侧卵巢并缝合伤口，余下10只仅开腹腔、切除卵巢周围的脂肪组织，不进行卵巢切除并缝合伤口，记作假手术组。正常饲养10周后，使用双能X射线骨密度仪检测60只大鼠骨密度值，当建模大鼠骨密度值低于假手术组大鼠骨密度值平均数2.5个标准差以上为建模成功。然后将大鼠右侧股骨中段切开骨膜，横向锯断股骨，立即使用克氏针将断骨固定后进行伤口缝合。将建模成功的大鼠随机分为5组，分别为模型组、阳性对照组及牛膝多糖高、中、低剂量组。建模术后第2天大鼠进行药物治疗，阳性对照组大鼠灌胃0.21 mg·kg-1尼尔雌醇，牛膝多糖高、中、低剂量组分别灌胃8 g·kg-1、4 g·kg-1、2 g·kg-1牛膝多糖，假手术组和模型组分别灌胃同体积生理盐水，每天1次，连续12周。

2.2 检测大鼠骨密度（bone m ineral density，BMD）水平 分别于给药前和给药12周后通过双能X线吸收测量法检测大鼠股骨BMD水平，将双能X线骨密度仪设置为Hi-red Small animal模式，检测大鼠股骨BMD水平。

2.3 检测大鼠骨代谢指标给药12周后，对大鼠进行尾静脉取血，收集血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清ALP、BGP、PINP、NTx、TRAP水平。

2.4 骨组织病理学检查每组随机选择3只大鼠，脱颈椎法处死后，取大鼠骨折端骨组织，经过甲醛固定过夜后加入10%EDTA溶液中脱钙4周。经过包埋、切片后使用HE染色试剂盒进行染色，操作参考产品说明书。经过中性树脂封片后，在光学显微镜下观察骨组织骨小梁的数量、排列情况、形态及连续性等。

2.5 检测骨质疏松性骨折模型大鼠骨折端骨组织中β-catenin mRNA、Runx2 mRNA、Osterix mRNA水平每组随机选择3只大鼠，颈椎脱臼处死后，取大鼠骨折端骨组织，加入液氮进行研磨，用RNA提取试剂盒提取组织中总RNA，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。查找目的基因mRNA序列，设计出上下游引物。β-catenin上游引物：5′-TAGTACCGATAGCTAAACTG-3′，下游引物：5′-TAAGTACCTCAATACGTAGA-3′，产物长度为121 bp；Runx2上游引物为：5′-TGACTTACGTCCAGTCAACG-3′，下 游 引 物 为：5′-TGGTACCTAGCTGGTAATAC-3′，产物长度为123 bp；Osterix上游引物：5′-TAACGTGCATCGGCTAACGT-3′，下游引物：5′-GATCCGTGCGGTACCATACT-3′，产物长度为119 bp；β-actin上游引物：5′-TGCACTTGCATGACTCGAAT-3′，下游引物：5′-GATTACCATCGGATCGGATA-3′，产物长度132 bp。按照cDNA 0.5μL，上下游引物各1μL，荧光预混试剂1μL，dNTP 1μL，ddH2O 5.5μL，总体积10μL的体系加入PCR的96孔板中。退火温度设置为58℃，40个循环。反应结束后，使用配套荧光采集系统得到各样品Ct值，以β-actin为持家基因，根据2-ΔΔCt得出目的基因水平。

2.6 W estem Blot法检测骨质疏松性骨折模型大鼠骨折端骨组织中β-catenin、Runx2、Osterixl及p-β-catenin蛋白表达每组随机选择3只大鼠，颈椎脱臼处死后，取大鼠骨折端骨组织，将骨折端骨组织中加入少许液氮，研磨匀浆后，加入细胞裂解液，在4℃摇床中过夜裂解后，10 000×g离心5 min，上清即为细胞总蛋白。用细胞核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白；加入上样缓冲液并在沸水中煮沸5 min使蛋白变性；用制胶试剂盒制胶并上样进行电泳，电泳结束后转膜，使用5%脱脂牛奶封闭，一抗孵育过夜，更换二抗室温孵育2 h，在暗室中使用ECL发光液显色，经过显影液、定影液处理后，在胶片上显示出目的条带。用扫描仪将胶片上的条带进行灰度值分析，以β-actin为参考，计算目的蛋白相对表达水平。

2.7 统计学方法采用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计学分析，实验数据均采用平均数±标准差（±s）表示，多组间比较使用单因素方差分析，两组间比较使用SNK-q检验。P＜0.05认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 对骨质疏松性骨折模型大鼠股骨BMD水平的影响50只建模大鼠，共48只建模成功。模型组和阳性对照组每组9只，牛膝多糖高、中、低剂量组每组10只。大鼠治疗期间，由于灌胃操作不当导致牛膝多糖高剂量组和中剂量组分别死亡1只。股骨BMD水平检测结果显示：治疗前，与假手术组比较，模型组、阳性对照组和牛膝多糖高、中、低剂量组大鼠BMD水平均显著降低（P＜0.05），各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，与假手术组比较，模型组大鼠BMD水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，牛膝多糖高、中、低剂量组与阳性对照组大鼠BMD水平显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 对骨质疏松性骨折模型大鼠股骨BMD水平的影响 （±s）

表1 对骨质疏松性骨折模型大鼠股骨BMD水平的影响 （±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 n治疗前/mg·cm-2 治疗后/mg·cm-2 10 268.44±21.24 269.09±20.05模型组 9 209.71±20.09* 197.26±15.36*阳性对照组 9 210.39±19.14* 243.47±12.01＃牛膝多糖高剂量组 9 214.33±33.54* 258.66±10.52＃牛膝多糖中剂量组 9 207.54±20.48* 242.21±19.33＃牛膝多糖低剂量组 10 209.64±26.98* 227.99±11.15假手术组＃

3.2 大鼠血清骨代谢指标与假手术组比较，模型组大鼠血清ALP、BGP和PINP水平显著降低（P＜0.05），NTx、TRAP水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，牛膝多糖高、中、低剂量组与阳性对照组大鼠血清ALP、BGP和PINP水平显著升高（P＜0.05），NTx、TRAP水平显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 大鼠血清骨代谢指标 （±s）

表2 大鼠血清骨代谢指标 （±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 n ALP/U·L-1 BGP（ρ/μg·L-1） PINP（ρ/μg·L-1）NTx（c/μmol·L-1）TRAP（ρ/μg·L-1）1.65 1.48.±0.34模型组 9 112.33±11.45* 0.91±0.13* 26.44±5.85* 19.35±4.87* 2.85±0.56*阳性对照组 10 156.70±15.05＃ 1.45±0.25＃ 62.81±7.12＃ 13.12±3.06＃ 2.28±0.16＃牛膝多糖高剂量组9 188.45±13.21＃ 1.71±0.18＃ 84.33±10.86＃ 10.01±1.82＃ 1.77±0.39＃牛膝多糖中剂量组9 155.38±18.33＃ 1.42±0.18＃ 65.50±7.01＃ 13.54±1.08＃ 2.21±0.25＃牛膝多糖低剂量组10 125.44±12.08＃ 1.19±0.12＃ 51.27±6.24＃ 16.99±1.39＃ 2.56±0.17假手术组 10 200.89±22.06 2.05±0.21 93.45±12.98 8.28±＃

3.3 大鼠骨折端骨组织病理学变化假手术组大鼠骨小梁粗大致密，粗细均匀且结构连续性好；模型组大鼠骨小梁数量减少，排列凌乱且稀疏，骨小梁连接性差，存在大片无骨小梁骨髓区；阳性对照组大鼠骨小梁连续性较好；牛膝多糖高、中、低剂量组随着剂量的增加，骨小梁逐渐数量增多，形态增粗，连续性增加。见图1。

图1 大鼠骨折端骨组织病理学观察（HE染色，×100）

3.4 对骨质疏松性骨折模型大鼠骨折端骨组织中β-catenin m RNA、Runx2 m RNA、Osterix m RNA水平的影响与假手术组比较，模型组大鼠骨折端骨组织β-catenin mRNA、Runx2 mRNA、Osterix mRNA水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，牛膝多糖高、中、低剂量组与阳性对照组大鼠骨折端骨组织β-catenin mRNA、Runx2 mRNA、Osterix mRNA水平显著升高（P＜0.05）。见表3。

表3 RT-qPCR检测骨折端骨组织中β-catenin m RNA、Runx2 m RNA、Osterix m RNA表达 （±s）

表3 RT-qPCR检测骨折端骨组织中β-catenin m RNA、Runx2 m RNA、Osterix m RNA表达 （±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 n β-catenin mRNA Runx2 mRNA Osterix mRNA假手术组0.88±0.21 1.25±0.45 0.74±0.21模型组 3 0.32±0.09* 0.47±0.06* 0.11±0.02*对照组 3 0.45±0.06＃ 0.72±0.12＃ 0.46±0.06＃牛膝多糖高剂量组 3 0.67±0.13＃ 0.95±0.17＃ 0.63±0.12＃牛膝多糖中剂量组 3 0.45±0.05＃ 0.76±0.12＃ 0.45±0.08＃牛膝多糖低剂量组 3 0.39±0.03＃ 0.58±0.08＃ 0.33±0.04 3＃

3.5 对骨质疏松性骨折模型大鼠骨折端骨组织中β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白及p-β-catenin表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠骨折端骨组织β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白表达显著下调（P＜0.05），p-β-catenin/β-catenin水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，牛膝多糖高、中、低剂量组与阳性对照组大鼠骨折端骨组织β-catenin、胞核βcatenin、Runx2、Osterixl蛋白表达显著上调（P＜0.05），p-β-catenin/β-catenin水平显著降低（P＜0.05）。见图2、表4。

表4 骨折端骨组织中β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白及p-β-catenin表达检测 （±s）

表4 骨折端骨组织中β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白及p-β-catenin表达检测 （±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

-actin假手术组 3 0.88±0.11 0.62±0.12 0.30±0.07 1.19±0.21 0.组别 n β-catenin/β-actin胞核β-catenin/β-actin p-β-catenin/β-catenin Runx2/β-actin Osterix/β 71±0.12模型组 3 0.34±0.07* 0.15±0.02* 1.05±0.18* 0.45±0.06* 0.21±0.04*阳性对照组 3 0.69±0.10＃ 0.35±0.06＃ 0.69±0.12＃ 0.73±0.12＃ 0.47±0.06＃牛膝多糖高剂量组 3 1.06±0.18＃ 0.79±0.13＃ 0.42±0.08＃ 0.94±0.16＃ 0.65±0.12＃牛膝多糖中剂量组 3 0.75±0.15＃ 0.36±0.07＃ 0.55±0.03＃ 0.77±0.08＃ 0.44±0.05＃牛膝多糖低剂量组 3 0.58±0.11＃ 0.23±0.03＃ 0.81±0.11＃ 0.58±0.08＃ 0.35±0.05＃

图2 骨折端骨组织中β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白及p-β-catenin表达检测

4 讨论

由于女性绝经后卵巢功能减退导致骨代谢紊乱、破骨细胞活性增强，使骨小梁吸收加快，成骨细胞活性相对减弱，骨形成速度缓慢，最终导致骨丢失，发生骨质疏松［8-9］。骨质疏松表现为骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加，增加了骨折的风险。骨质疏松性骨折常见脊柱骨折、尺桡骨骨折、髋部骨折等，严重降低患者的生活质量［10］。尼尔雌醇是雌激素类药物，也是绝经期妇女防治骨质疏松的常用药物，具有吸收好、效果明显的特点［11］。但有研究表明，长期使用雌激素类药物可能会引起头痛、高血压、子宫出血，增加患卵巢癌、子宫肌瘤的风险等不良反应［12］。本研究通过摘除大鼠双侧卵巢后，经双能X线骨密度仪检测BMD水平均降低，骨质疏松大鼠经过右侧股骨骨折后，骨质疏松骨折大鼠模型制备成功。

本研究中牛膝多糖高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠经过12周的治疗后，BMD水平显著提高，骨代谢发生改善，提示常规西药和牛膝多糖均能增强骨质疏松症大鼠的骨密度。本研究还发现，经过牛膝多糖治疗后，大鼠血清NTx和TRAP水平较模型组均降低，表明牛膝多糖具有抑制骨吸收的作用。ALP在成骨过程中能水解磷酸酯和焦磷酸盐活性，有利于骨矿化，促进骨形成［13-14］。血清中ALP水平可能来自骨组织及肝脏等其他组织。因此，检测机体骨形成水平还需更具特异性的骨形成指标如BGP来验证。BGP主要由成骨细胞合成，可与骨基质结合，维持骨正常矿化速度，血清中BGP水平的高低可反映成骨细胞活性［15-16］。人体骨基质中约90%的成分为Ⅰ型胶质，PINP是Ⅰ型胶原前体转化为胶原纤维质的过程中裂解的产物之一。当一个胶原分子合成，会产生一个PINP分子，因此，PINP直接反映出Ⅰ型胶原合成速率［17］。本研究结果显示，牛膝多糖组大鼠血清中ALP、BGP和PINP水平均较模型组升高，表明牛膝多糖可促进骨形成。骨质吸收过程中，NTx是骨胶原纤维降解产物。因此，血清中NTx反映了骨吸收水平，是骨吸收的特异性指标［14］。TRAP主要由破骨细胞释放，对骨基质中矿化底物进行降解，反映了破骨细胞活性［15］。牛膝归肝、肾经，有补肝肾、健筋骨、活血化瘀的功效，可用于治疗肝肾亏虚、跌打瘀痛、腰膝酸痛、筋骨无力等［18-19］。牛膝多糖是牛膝的活性成分之一，可用于治疗骨性关节炎［20］。李开言等［21］研究表明，牛膝多糖含药血清应用于损伤的软骨细胞可提高其增殖活性，对改善骨代谢、防治骨质疏松症具有重要意义，与本研究结果相符。

Wnt/β-catenin信号通路不仅在胚胎发育过程中发挥重要调节作用，在骨代谢过程中也十分关键［22-23］。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子，无Wnt信号激活时，β-catenin会被Axin/APC/GSK 3β复合体磷酸化并被溶酶体降解，当Wnt信号被激活时，β-catenin不发生磷酸化，可进入细胞核激活其下游信号因子Runx2［24］。Runx2是Runt家族成员之一，是成骨分化的特异性转录因子。研究表明，Runx2基因缺失可导致成骨细胞分化被抑制，骨膜成骨和软骨内成骨会被抑制［25］。此外，Runx2可促进Ⅰ型胶原合成，提高ALP、BGP、PINP水平，抑制NTx和TRAP水平［26］。Osterix是Runx2下游信号因子，也是骨发育过程中主要调节因子之一。研究表明，Osterix基因敲除小鼠，Runx2表达正常，敲除小鼠Osterix基因无法正常表达，且成骨细胞无法发育为成骨细胞［27］。因此，Osterix与Runx2在成骨细胞增殖分化和骨代谢过程中发挥重要作用。本研究中经过牛膝多糖治疗后β-catenin、胞核β-catenin、Runx2和Osteri蛋白表达增加而p-β-catenin水平下降。郎小琴等［28］对老年骨质疏松大鼠模型灌胃牛膝多糖发现，骨形成指标水平均升高，而骨吸收指标水平降低，与本研究结果一致；此外，还发现大鼠双侧最大应力及断裂吸收能量显著升高，证实牛膝多糖不仅可改善老年骨质疏松大鼠的骨代谢水平，还可降低骨折风险。Li R等［29］研究显示，微小核糖核酸-23b-3p可阻断Wnt/β-catenin信号通路参与绝经后骨质疏松，且发现p-β-catenin表达升高，而该通路下游的Runx2和Osterix表达下降。由此推测，牛膝多糖可提高大鼠骨密度，改善骨代谢水平可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

综上所述，牛膝多糖可提高骨质疏松骨折模型大鼠骨密度，改善大鼠骨代谢水平，减轻大鼠骨组织病理损伤，可能与激活Wnt/β-catenin信号通路，上调β-catenin、胞核β-catenin表达，下调p-β-catenin表达，从而促进下游Runx2和Osterix表达有关。本研究为骨质疏松骨折患者治疗提供新思路。由于参与骨形成信号通路较多，是否影响其他信号通路尚未涉及，需进行进一步研究。