基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究复方蜥蜴散凝胶对胃癌前病变模型大鼠的调控作用*

王艺臻，王佳林，朱西杰

1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学附属回医中医院，宁夏 银川 750004

胃癌前病变（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）指在慢性萎缩性胃炎基础上伴肠上皮化生和异常增生的疾病，是正常胃黏膜向胃癌逐步转化的过程，具有临床表现不典型、发病不明显、病程迁延难愈等特点［1］。研究发现，PLGC的发生与饮酒、喜食腌制食物、饮食不规则、喜食油煎食物、喜食辛辣食物、幽门螺杆菌感染、消化道肿瘤家族史、焦虑、抑郁等危险因素密切相关［2］。研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路在胃癌细胞中出现异常活化。当肿瘤细胞的生存环境有压力时，该通路被激活，参与调节细胞的生长、增殖、凋亡、迁移、血管生成和周期运行［3］。因此，PI3K/AKT/mTOR信号通路被认为是在外环境压力下细胞生存的关键调节因素［4］。本研究将通过单功能烷化剂甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）配合饥饱失常及情绪刺激综合因素诱导大鼠PLGC模型，观察复方蜥蜴散凝胶对大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，为中医药治疗PLGC提供新思路。

1 材料

1.1 动物SPF级健康雄性SD大鼠120只，许可证号：SCXK（宁）2015-0001，6～8周龄，体质量180～220 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，饲养于宁夏医科大学SPF级动物房，16 h/8 h：光照/黑夜循环，温度（22±2）℃，湿度45%～50%，自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂复方蜥蜴散凝胶（由宁夏密点麻蜥15 g，黄芪30 g，党参15 g，山药15 g，白术15 g，元胡10 g，枳壳15 g，砂仁10 g，旋覆花10 g，佛手10 g，白芍15 g，乌梅10 g，半夏10 g组成，由宁夏医科大学中医消化病研究所提供）；维酶素（乐普恒久远药业有限公司，批号：H41024448）。MNNG（日本东京化成工业株式会社，批号：8WF3NLC））；磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）抗体（北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-0128R）；AKT抗体（北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-0115R）；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）（北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-1992R）；BCA蛋白定量试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：KGPBCA）；TBST（北京中杉金桥生物技术有限公司，货 号：p25133）；ECL发 光 液（南 京 凯 基，货 号：KGP1127）；PVDF膜（Millipore公 司，货 号：IPVH00010）；蛋白marker（美国Thermo公司，货号：26616）；Tris（日本Biofount公司，货号：SS1426）。

1.3 仪器电热恒温培养箱（南京实验仪器厂，型号：HH.B11.600）；冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：centrifuge5417R）；光镜（日本Olympus公司，型号：CKX41）；旋涡混合器（美国SI公司，型号：SI-0246）；切片机（德国Leica公司，型号：RM2016）；电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号：1658033）；凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司，型号：XR＋）。

2 方法

2.1 动物分组与模型制备将健康SPF级SD雄性大鼠120只，随机分为6组，即空白组、模型组、维酶素组、复方蜥蜴散凝胶（高、中、低剂量）组，每组20只。除空白组外，其余各组大鼠连续24周灌胃0.02 mol·L-1MNNG溶液（5 g·kg-1）及加入等浓度的MNNG溶液自由饮用，辅助采取2日饱食、1日饥饿的饥饱失常法，饱食日自由饮食，饥饿日禁食不禁水，配合情绪刺激复制PLGC模型［5-7］，空白组大鼠给予同体积蒸馏水饮用。

2.2 模型鉴定及给药除空白组外，其余组随机抽取3只大鼠，杀检，取病变胃黏膜，进行HE染色。若杀检大鼠胃黏膜出现炎性细胞浸润，杯状细胞增多，腺体减少、萎缩及排列不规则等病理变化，则为PLGC模型复制成功。

复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组分别以28 g·kg-1、14 g·kg-1、7 g·kg-1灌胃，维酶素组以7 g·kg-1灌胃，空白组和模型组大鼠给予同体积生理盐水灌胃，每天1次，连续给药12周。

2.3 HE染色观察大鼠胃组织病理变化每组随机选取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 g·kg-1），将其麻醉处死后，剖腹，在距贲门和幽门1.5 cm处分离出全胃，沿胃大弯侧切开，生理盐水冲洗，滤纸吸干铺开，肉眼观察胃黏膜的色泽形态、有无糜烂出血及增生等，然后从胃底处取2 cm×3 mm纵切条状组织，置于40 ng·L-1多聚甲醛固定24 h，梯度脱水后，石蜡包埋，对其进行脱蜡：用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脱蜡各10 min；入水：乙醇100%乙醇Ⅰ和Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇各5 min→自来水冲洗5 min→苏木素染色10 min→自来水冲洗30 min→盐酸乙醇分化15 s→自来水冲洗30 min→伊红染色5～8 min；过水；脱水：70%乙醇1 min→80%乙醇1 min→90%乙醇5 min→95%乙醇5 min→100%乙醇Ⅰ和Ⅱ各5 min；透化：二甲苯Ⅰ和Ⅱ各10 min；中性树脂封片；显微镜下观察大鼠胃组织病理变化［8-10］。

2.4 Western Blot法检测大鼠胃组织PI3K、AKT、m TOR蛋白表达 每组选取6只大鼠的胃组织，将病变胃组织胃体部剪碎，加入裂解液30 min后，4℃，13 000 rpm·min-1离心5 min，吸取上清，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，取总蛋白沸水浴加热变性后，取25μL上样缓冲液，SDS-PAGE凝胶电泳；蛋白电泳分离后移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；置一抗稀释液中，4℃过夜；洗涤3次，置二抗稀释液中，室温孵育1 h；显色，以β-actin蛋白表达为参照，Image-proplus（Version 4.1）系统采集数据，图像分析系统的光密度值为条带灰度密度值和相应的β-actin灰度密度值的比值作为指标进行结果分析［11］。实验重复3次。

2.5 统计学方法采用SPSS 21.0软件对数据进行处理，计量资料采用均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析。假设检验采用双侧检验，取α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对大鼠一般行为的影响除空白组，模型组大鼠出现大便不成形、精神状态萎靡、扎堆少动、毛色晦暗无泽；复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组及维酶素组大鼠的粪便成颗粒状、精神状态佳、活跃、毛色光洁。

3.2 对大鼠胃组织病理变化的影响空白组大鼠胃黏膜表面光滑平整，腺体结构完整清晰可见，排列整齐，细胞形态正常，无炎性细胞浸润；模型组大鼠胃黏膜组织及腺体萎缩，细胞形态改变，杯状细胞增多，大量炎性细胞浸润，排列紊乱不规则；复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组及维酶素组大鼠胃黏膜组织病理表现有痊愈趋势，腺体增多，排列规则，炎性细胞及杯状细胞浸润减少，其中以复方蜥蜴散凝胶高剂量组最为明显。见图1。

图1 大鼠胃组织病理学变化（HE染色，×200）

3.3 对大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，复方蜥蜴散凝胶高、中、低剂量组及维酶素组大鼠胃组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达显著下调（P＜0.05）。

图2 对大鼠胃组织PI3K、AKT、m TOR蛋白表达的影响

4 讨论

PLGC的发生、发展过程中，脾胃虚弱贯穿于其病程的始末［12］。脾胃为后天之本、气血生化之源，与机体的正气盛衰和抗病能力密切相关。MNNG溶液作为外来邪气侵袭，当受到饥饱及情绪失常等因素刺激时，可致大鼠脾胃虚弱，加之失于调养，致脾胃不能腐熟水谷，通降功能失常，出现食入不化，胃气上逆，呕吐清水并夹杂不消化食物，最终导致气血生化乏源，出现形体枯槁，生理功能失常等一系列病理变［13］。此外，中气亏虚、气虚不足以行血，则血行迟缓，逐渐壅滞成瘀，瘀血日久致各种毒素产物堆积。胃肠道动力的异常，黏膜失养而致其增生等，从而诱导PLGC的发生［14］。采用宁夏本土道地药材密点麻蜥为主要药物组成的复方蜥蜴散凝胶，有益气养血、化瘀解毒之功效，可起到抗癌、抑癌、阻癌的治疗效果。研究表明，宁夏密点麻蜥对胃肠道有亲和力和靶向作用，可修复甚至逆转胃肠道损伤的黏膜［15］，治疗PLGC临床效果显著。以凝胶为给药形式，使药物能够很好地黏附在胃黏膜上，形成保护膜，促进黏膜修复，创新蜥蜴散剂的给药形式［16］。

研究表明，P13K/AKT/mTOR信号通路与细胞增殖关系密切，可能与肿瘤的发生发展密切相关［17］，在细胞的生理病理活动过程中发挥至关重要作用［18］。研究发现，PI3K/AKT/mTOR信号通路在胃癌细胞中出现异常活化，上游信号刺激时，PI3K活化，激活AKT，活化的AKT可直接激活mTOR，使其发生磷酸化，参与调控生物大分子如蛋白质、核苷酸、脂质等的合成过程，为肿瘤细胞生长提供了必要的物质基础［19-20］。PI3K蛋白是信号通路的重要组成分子，是一种在肿瘤细胞质与细胞核阳性表达的复合体，可参与细胞迁移等，还可调控肿瘤细胞的糖酵解过程［21-22］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）是一种丝氨酸苏氨酸激酶，对肿瘤细胞的存活及凋亡起到重要作用。AKT能促进葡萄糖转运子的膜转位，增加葡萄糖摄取，促进糖酵解［23-24］。mTOR是细胞生长和增殖的重要调节因子，为PI3K/AKT/mTOR信号通路中下游的重要激酶之一，参与肿瘤细胞存活、增殖、侵袭与迁移等。研究发现，mTOR蛋白在癌肿细胞的细胞核中过度活化，通过调节核苷酸、葡萄糖等生物小分子的摄取，改变mTOR信号中某些关键代谢酶的结构，影响癌肿组织的生长及代谢［25-27］。PI3K/AKT通过激活下游靶点mTOR，诱导上皮间质转化的发生，促进肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶，进而降解、破坏细胞外基质，使肿瘤细胞脱离原发部位而发生侵袭和转移［28］。P13K/AKT/mTOR信号通路不但参与调控肿瘤细胞增殖与凋亡，还与血管生成密切相关。血管生成是肿瘤赖以生长、转移并具有致死性的基础［29］。

本实验结果显示，复方蜥蜴散凝胶高剂量组药效明显优于其他组，可有效缓解PLGC模型大鼠的症状，其作用机制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关，通过调控此通路，干预细胞的上皮-间质转化，改善黏膜外环境，以平衡胃黏膜细胞异常增殖凋亡，防止细胞过度增殖分化，使机体处于“阴平阳秘”，三焦气化功能正常，提高机体抗邪能力，为胃黏膜组织细胞功能的恢复提供有利环境［30］，从而阻断PLGC的发生。