基于大鼠唾液生化指标的肾虚、脾虚体质差异研究*

孙瑜嬬，史鹏云，王梓安，孙理军

陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

《素问·宣明五气》中指出：“五脏化液，心为汗，肺为涕，肝为泪，脾为涎，肾为唾，是谓五液。”在中医学理论中，“涎”与“唾”是两种重要概念，都归属于“五液”，但涎、唾二者，无论是在其生成、与脏腑的关系或是病理变化等方面都有着区别，由于其皆出于口，是口腔分泌物，临床中很难将二者区分开来，因此常合称为“唾液”“唾沫”等。现代药理研究证实唾液与脾肾关系密切［1-4］，但唾液与脾肾之间的关系又不十分明确。为了进一步探讨唾液与脾肾之间的关系，本实验制备肾虚体质、脾虚体质动物模型，研究肾虚、脾虚病理体质状态下唾液腺形态和生化指标的变化，从而探讨脾、肾对唾液影响的差异。

1 材料

1.1 动物8周龄SPF级SD大鼠，雌鼠15只，雄鼠5只，体质量180 g～220 g，购买于西安第四军医大学实验动物研究中心，合格证号：SCXK（陕）2018-003。室温20～26℃，标准饲料喂养，自由饮水进食。成熟土猫1只，凶狠善斗，前期猫粮喂养，造模期间以猫粮并不定期投入实验淘汰掉的子代鼠喂养。

1.2 药物与试剂苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120）；无水乙醇（安徽安特股份有限公司，批号：1308073601）；生理盐水（西安京西双鹤药业有限公司，批号：172703）；多聚甲醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批 号：20100318）；电 解 质 检 测 液、钙 离 子（Ca2＋）、磷离子（P5＋）、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、尿素（urea，UREA）、肌酐（creatinine，CREA）、尿酸（uric acid，UA）测定试剂盒（美国贝克曼库尔特有限公司，货号：66313、OSR61117、OSR6122、OSR6132、OSR6102、OSR6128、OSR6107、OSR6109、OSR6104、OSR6134、OSR6178、OSR6198）；匹鲁卡品（山东博士伦福瑞达制药有限公司生产，国药准字：H19983028）；二甲苯、医用石蜡（成都市科龙化工试剂厂，批号：20130306、20100302）；中性树胶（中国上海标本模型厂，批号：20141205）。

1.3 仪器FT-200小动物跑步机（成都泰盟软件有限公司）；HJT-B＋1000G型天平（华杰电子有限公司）；CB880V洁净工作台（苏洁医疗器械（苏州）有限公司）；贝克曼Au5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；KDC-40低温离心机（离心半径：13 cm，科大创新股份有限公司）；ZT-12J生物组织自动脱水机（湖北亚光医用电子技术有限公司）；JB-L6生物组织包埋机、JJQ-P2016j切片机（武汉俊杰电子有限公司）；A1型显微镜（德国Zeiss公司）。

2 方法

2.1 动物分组及模型制备20只SD大鼠适应性喂养1周，雌雄比例为3∶1合笼交配。待雌鼠成功受孕后，将15只孕鼠随机分为A、B、C 3组（n＝5）。A组孕鼠每日8∶00～20∶00置于特质鼠笼，将鼠笼固定于内有凶狠土猫的大笼内，孕鼠与土猫间仅有一层铁丝网相隔，猫爪能够触碰孕鼠但不能将之捕获；使A组孕鼠处于恐吓状态直至先天不足的子代鼠（仔鼠）出生。B、C组孕鼠不做任何刺激正常产子。待3组孕鼠产下仔鼠后，将仔鼠正常喂养4周后进行分组。

选取A组孕鼠所产仔鼠，雌雄各半，继续上述“猫吓鼠”恐吓刺激，并不定期投入实验淘汰掉的仔鼠喂养土猫，使仔鼠在旁观看强化恐吓刺激，持续4周，所得仔鼠为先天不足＋后天失养复合型肾虚质模型鼠［5-9］，选取10只模型鼠为肾虚质组。

随机选取B组孕鼠所产仔鼠，雌雄各半，不规律喂食使其饥饱无度，并于每日8∶00将其放置在小动物跑步机上跑步30 min，速度10 m·min-1，六个跑道后方均装有电击装置，仔鼠若触碰则会遭受电击。为避免电击惩罚，仔鼠将持续向前奔跑直至精疲力竭。以仔鼠出现跑步吃力，半卧位姿势跑步，降低跑道转速度后仍无法恢复跑动能力，停止运动后出现气促、神倦，且对外界刺激不敏感为力竭标准。4周后所得仔鼠为饮食不节＋劳倦过度复合型脾虚质模型鼠［10-12］，选取10只作为脾虚质组。

C组孕鼠所产仔鼠随机选取10只，雌雄各半，标准饲料喂养，自由饮水进食，为平和质组。

2.2 各组仔鼠一般情况检测分别在仔鼠6周龄和8周龄时称重，并观察各组仔鼠的神态、活动能力、饮食、毛色等变化。

2.3 唾液生化指标检测造模结束后，各组仔鼠禁食12 h后称重，以10 mL·kg-1剂量腹腔注射300 mg·kg-1水合氯醛麻醉［13］，腹腔注射0.2%匹鲁卡品（7.5 mg·kg-1）促进唾液分泌［14］，于仔鼠麻醉状态下收集唾液。将收集的唾液3 000 rpm·min-1离心10 min，取上清液，于-80℃保存待用，用全自动生化分析仪测定唾液生化指标。

2.4 唾液腺组织切片观察处死动物后快速摘取唾液腺置于4%多聚甲醛溶液固定，自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片机切片（厚度为5μm），常规HE染色，显微镜下观察组织切片。

2.5 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，结果以平均值±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组仔鼠一般生长情况比较平和质组仔鼠饮食正常，体格健硕，体质量增长迅速，精神良好，活动度高，毛发密实有光泽，二便正常。造模时，A组孕鼠成群蜷缩在笼子角落，瑟缩易惊，大小便增多，摄食量减少，产子量明显减少，仔鼠体格瘦小，蜷卧少动，皮毛松弛，毛发稀疏灰暗、光泽度差；脾虚质组仔鼠饮食逐渐减少，体型消瘦，体质量增长缓慢，精神萎靡不振，大便增多。对仔鼠第6、8周称重检测发现，与平和质组比较，肾虚质组仔鼠第8周体质量显著降低（P＜0.01），脾虚质组第6、8周体质量均显著降低（P＜0.01）；与肾虚质组比较，脾虚质组第6、8周时仔鼠体质量均显著降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组仔鼠第6周、第8周体质量比较 （±s，n＝10）

表1 各组仔鼠第6周、第8周体质量比较 （±s，n＝10）

注：与平和质组比较，**P＜0.01；与肾虚质组比较，△△P＜0.01

/g平和质组组别 第6周体质量/g 第8周体质量74.60±8.43 112.62±10.91肾虚质组 67.54±10.37 98.55±9.85**脾虚质组 56.79±5.36**△△ 73.17±6.47**△△

3.2 各组仔鼠唾液中相关离子比较对各组仔鼠唾液中相关离子水平检测发现，与平和质组比较，肾虚质组仔鼠唾液中Na＋、Cl-的水平显著降低（P＜0.01），K＋、P5＋的水平显著升高（P＜0.01），而Ca2＋水平无明显变化；脾虚质组仔鼠唾液中Na＋、Cl-的水平显著降低（P＜0.01），K＋的水平显著升高（P＜0.01），而Ca2＋、P5＋的水平无明显变化。与肾虚质组比较，脾虚质组Cl-、P5＋水平显著降低（P＜0.05），其他离子水平无明显变化。见表2。

表2 各组仔鼠唾液中相关离子比较 （±s，n＝10）

表2 各组仔鼠唾液中相关离子比较 （±s，n＝10）

注：与平和质组比较，**P＜0.01；与肾虚质组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05

组别 Na＋（c/mmol·L-1） K＋（c/mmol·L-1） Cl-（c/mmol·L-1） Ca2＋（c/mmol·L-1） P5＋（c/mmol·L-1）0.29±0.03肾虚质组 24.79±4.46** 26.56±2.28** 28.18±1.45** 0.40±0.05 0.32±0.02**脾虚质组 21.70±3.68** 27.55±1.90** 26.87±1.14**△ 0.45±0.05 0.28±0.02平和质组 34.04±6.35 20.19±2.50 31.61±2.66 0.41±0.06△△

3.3 各组仔鼠唾液中TP、ALB的比较对各组仔鼠唾液中TP、ALB水平检测发现，与平和质组比较，肾虚质组仔鼠唾液中TP、ALB的水平显著升高（P＜0.01）；脾虚质组仔鼠唾液中TP、ALB的水平显著升高（P＜0.01）。与肾虚质组比较，脾虚质组TP、ALB的水平无明显变化。见表3。

表3 各组仔鼠唾液中TP、ALB的比较（±s，n＝10）

表3 各组仔鼠唾液中TP、ALB的比较（±s，n＝10）

注：与平和质组比较，**P＜0.01

组别 TP（ρ/g·L-1） ALB（ρ/g·L-1）3.12±0.66 0.29±0.05肾虚质组 7.21±1.44** 0.40±0.08**脾虚质组 6.84±1.16** 0.41±0.07平和质组**

3.4 各组仔鼠唾液中LDH、ALT、AST、ALP的比较对各组仔鼠唾液中LDH、ALT、AST、ALP水平检测发现，与平和质组比较，肾虚质组仔鼠唾液中ALT的水平显著降低（P＜0.05）；脾虚质组仔鼠唾液中AST的水平增高（P＜0.05）。与肾虚质组比较，脾虚质组LDH、ALT、AST、ALP的水平无明显变化。见表4。

表4 各组仔鼠唾液LDH、ALT、AST、ALP的比较 （±s，n＝10）

表4 各组仔鼠唾液LDH、ALT、AST、ALP的比较 （±s，n＝10）

注：与平和质组比较，*P＜0.05

组别 LDH/IU·L-1 ALT/IU·L-1 AST/IU·L-1 ALP/IU·L-1 93.80±8.30 6.63±1.28 18.71±3.15 7.53±1.43肾虚质组 98.80±7.60 5.33±1.02* 21.79±4.30 7.12±1.42脾虚质组 96.90±9.15 6.35±1.23 23.22±4.31*平和质组8.06±1.61

3.5 各组仔鼠唾液中UREA、CREA、UA的比较对各组仔鼠唾液中UREA、CREA、UA水平检测发现，与平和质组比较，肾虚质组仔鼠唾液中CREA、UA的水平显著增高（P＜0.01）；脾虚质组仔鼠唾液中UA的水平显著增高（P＜0.01）。与肾虚质组比较，脾虚质组CREA的水平显著降低（P＜0.01）。见表5。

表5 各组仔鼠唾液UREA、CREA、UA的比较 （±s，n＝10）

表5 各组仔鼠唾液UREA、CREA、UA的比较 （±s，n＝10）

注：与平和质组比较，*P＜0.01；与肾虚质组比较，△P＜0.01

组别 UREA（c/mmol·L-1）CREA（c/mmol·L-1）UA（c/mmol·L-1）4.63±0.72 4.67±0.88 4.71±0.94肾虚质组 5.23±1.03 9.84±1.40** 6.45±1.19**脾虚质组 5.10±1.01 5.07±1.01△△ 6.40±0.88平和质组**

3.6 各组仔鼠唾液腺组织切片观察采用HE染色观察不同模型下仔鼠唾液腺的病理变化。平和质组唾液腺结构完整、分叶明显，腺管结构排列紧密，导管及腺细胞密集，偶见腺小叶、腺泡局灶性萎缩；肾虚质组唾液腺结构较完整，分叶明显，可见腺泡、导管结构出现片状萎缩，腺上皮细胞部分脱落，部分细胞核溶解、消失，导管结构不清晰，细胞间质增宽伴细胞水肿；脾虚质组唾液腺结构完整，分叶明显，腺管结构出现片状萎缩，腺管基底膜尚存，管状结构清晰。见图1。

图1 各组仔鼠唾液腺组织病理观察（HE染色，×200）

4 讨论

唾液，是中医“唾”与“涎”的合称，又被称为“金精玉液”，是滋润濡养、化生血液、调节阴阳的重要物质。《灵枢·九针论》中再次明确了“肾主唾，脾主涎”，唾液与脾肾关系密切［15］。现代研究证实，唾液成分的改变影响机体生长发育，并与多种疾病的发生密切相关［16-18］。病理体质决定了个体对某些疾病的易感性，是疾病发生的内在基础［19-20］。

肾虚体质主要以肾精亏损、脏腑功能虚弱为表现，与多种慢性疾病和老年性疾病的发生密切相关［21］。脾虚体质是以脾气亏虚，脾胃功能低下，易受邪染病为主要特征的一种病理体质［22］。肾虚、脾虚体质同属病理体质范畴［23-24］，从唾液相关指标研究肾虚、脾虚体质差异对发展中医特色的无创伤体质辨识技术和微观辨证及预警都将具有重要的意义［25］。

本实验通过制备肾虚、脾虚体质动物模型，对比观察各组仔鼠6周龄、8周龄体质量发现，肾虚质组、脾虚质组体质量均显著低于平和质组，但与肾虚质组间比较，脾虚质组6周龄和8周龄时的体质量更低，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示脾虚质对体质量的影响较肾虚质更直观、更明显。脾虚质动物脾胃功能衰退，后天之本虚弱，枢机不利，气血生化无源，四肢无法充养，肌肉瘦削、体质量骤降。肾虚质动物肾中精气亏虚，肾脏蒸化、封藏、摄纳等功能失常，不能化气行水，间接影响脾胃功能，肾中藏纳的液态营养物质也不能上注于舌窍，引起唾液异常分泌［26］。对唾液腺组织观察发现，与平和质组唾液腺结构完整、腺管排列整齐致密不同，肾虚质、脾虚质组唾液腺出现了不同程度的细胞和组织损伤。

Na＋是细胞外液中带正电荷的离子，与K＋、Cl-共同参与人体的新陈代谢，维持机体水液分布的平衡。肌肉运动、氧的利用、心血管功能的发挥均需要钠的参与。K＋是人体内不可或缺的常量元素，与Na＋协同调节机体电解质的平衡。K＋浓度的轻微变化可能对肌肉系统、神经系统、心脏产生严重影响［27］。Cl-可以调节人体的酸碱平衡，与H＋结合形成胃酸，在促进淀粉酶激活的同时可以抑制胃中微生物的生长。Ca2＋存在于细胞外液，在神经传导、酶的激活、肌肉收缩过程中均起调节作用。磷是骨骼和牙齿的重要成分，也是传达神经刺激和维持肾脏正常机能的重要物质。CREA是由肌肉中的肌酸或磷酸代谢，经肾脏排泄出的一种小分子物质。当肾功能受损时，CREA排泄受到阻碍，CREA透过细胞膜或黏膜，引起唾液中CREA的浓度升高。UREA是由氨基酸分解、经肝内合成，再由血液运输，通过肾脏排至体外的代谢物。当肾脏发生疾病时，UREA排泄障碍，体液中UREA浓度自然升高。尿酸是嘌呤分解代谢的终末产物，肾实质的变化影响尿酸的正常分泌［28-29］。本实验通过对肾虚体质、脾虚体质及正常体质的唾液生化指标进行对比发现，与平和质组比较，肾虚质组大鼠Na＋、Cl-、ALT含量显著降低，K＋、P5＋、TP、ALB、CREA、UA含量显著升高；脾虚质组Na＋、Cl-含量显著降低，K＋、TP、ALB、AST、UA含量显著升高。与肾虚质组比较，脾虚质组Cl-、P5＋、CREA显著降低，但其余指标二者比较并无显著差异，Cl-、P5＋、CREA是否为肾虚质、脾虚质鉴别的标志物，还有待进一步研究。

综上所述，在肾虚、脾虚病理体质下，大鼠生长发育迟缓，唾液腺组织形态、唾液生化指标均发生了明显变化，进一步说明病理体质的亚健康状态对机体的影响。同时，肾虚质、脾虚质唾液除了Cl-、P5＋、CREA含量有显著差异外，其余生化指标并无显著变化，进一步说明脾肾两脏共同调控津液在机体内运行输布，唾液为脾肾共同所主这一理论的科学性。