薯蓣皂苷对弗氏佐剂诱导类风湿关节炎大鼠的影响*

刘佳钰，李锐，周威，张光伟，倪丹红，刘丹，李娟

1.西安市第五医院，陕西 西安 710082；2.西安医学院，陕西 西安 710021

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的慢性炎性疾病，以侵蚀关节滑膜慢性炎症为主要临床表现，严重时可发生关节损伤、畸形或残疾，具有病程长、迁延难愈、致残率高等特点，增加患者的医疗负担，降低生活质量［1］。目前，治疗RA的药物主要是拮抗不同炎症通路的生物制剂，如依那西普、妥珠单抗等。临床治疗费用昂贵，且只对部分患者有效，故迫切需要疗效肯定且不良反应小的药物。

薯蓣皂苷是广泛存在于薯蓣科、百合科和石竹科等中药中的呋甾烷醇皂苷，可用于治疗多种免疫疾病［2］。研究发现，薯蓣皂苷或甲基化薯蓣皂苷通过抑制白细胞介素-1β（interleukin1-β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、环氧化酶-2（cyclooxyganese-2，COX-2）和前列腺素-E2（prostaglandin E2，PGE2）等促炎细胞因子，从而抑制炎症反应［3-4］。然而，薯蓣皂苷对RA的抗炎作用报道较少。本研究应用完全弗氏佐剂（complete freund′s adjuvant，CFA）诱导RA大鼠模型，观察薯蓣皂苷对其影响，旨在探讨薯蓣皂苷治疗RA可能的作用机制，以期为后续相关探索工作奠定基础。

1 材料

1.1 动物40只SPF级6周龄SD雄性大鼠，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。饲养于西安交大医学院实验动物中心，使用许可证件号：SCXK（陕）2015-0001。自由饮食，室温（24±1）℃，湿度（55±5）%，每日7∶00～19∶00光照。本研究获得陕西师范大学动物伦理委员会批准，伦理批号：20160901。

1.2 药物与试剂薯蓣皂苷（纯度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-15081101）。CFA（美国Sigma公司，货号：068K8772）；PGE2 ELISA试剂盒（上海通蔚生物科技有限公司，批号：385r1229）；SYBR ExScript qRT-PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司，批号：DRR039s）；Triol RNA试剂盒（日本Takara公司，批号：PK0542）；Easy-Script First-Strand cDNA Synthesis Mix（日本Takara公司，批号：AIG1952A）；PCR定量试剂盒（日本Takara公司，批号：H2001081）。

1.3 仪器Vasrioskan Flash型全波长多功能酶标仪（美国Thermo公司）；5450型离心机（德国Eppendorf公司）；TP1020型脱水装置（德国Leica公司）；RM2235型切片机（德国Leica公司）；YD-AB型烘烤机（浙江金华益迪公司）；DHG-9203型恒温干燥鼓风干燥机（上海精密实验设备厂）；Shandon Gemini型染色机（美国Thermo公司）；DP2-BSM型病理图像采集系统（日本Olympus公司）；足趾容量测量仪（意大利UGO公司）；7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

2 方法

2.1 大鼠分组及造模将40只大鼠随机均分为对照组、模型组、薯蓣皂苷低剂量（50 mg·kg-1）组、薯蓣皂苷中剂量（100 mg·kg-1）组、薯蓣皂苷高剂量（200 mg·kg-1）组，每组8只。除正常组外，其余大鼠在左后肢皮下注射100μL CFA复制RA模型［5-6］，对照组注射等体积的生理盐水。免疫1周后，连续灌胃相应的药物15 d。

2.2 关节炎程度的评估分别于给药第5天、第10天、第15天，观察并记录大鼠一般情况，包括大鼠的体质量、饮食状况、毛发、整体状态及关节红肿情况等；同时用足趾容量测量仪测量小鼠足爪趾体积，评估关节炎程度［6］。

2.3 ELISA法检测大鼠血清PGE2水平给药结束后，用体积分数7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠腹主动脉取血，3 000 r·min-1离心10 min，取血清，ELISA法检测大鼠血清PGE2水平。

2.4 RT-qPCR法检测IL-1βmRNA、TNF-α mRNA、COX-2m RNA、I L-6 m RNA水平 取上述大鼠血清，用Trizol试剂提取总RNA，逆转录反应体系为50μL，反应条件：37℃15 min，85℃5 s。扩增反应体系25μL，反应条件：95℃×30 s、95℃×30 s、60℃×40 s（共40个循环）、65℃×5 min。实验重复3次。采用相对定量法（2-ΔΔCT法）计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 大鼠关节组织病理学检查每组随机选3只大鼠，取血后切取后肢踝关节，分离周围软组织，置于40 ng·L-1多聚甲醛中，用于后续组织病理学检测。将大鼠关节组织用不同浓度的乙醇逐级脱水，二甲苯透明，包埋，切片，其厚度大约为4μm，再对其进行脱蜡处理，染色试剂行苏木素-伊红（HE）染色。显镜下观察大鼠关节组织病理学变化。

2.6 统计学方法采用SPSS 21.0软件对数据进行分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较用LSD法，方差不齐时用Dunnett′s T法。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠的一般情况对照组大鼠状态良好，毛色光滑，饮食及排便正常，活动力良好；模型组大鼠活动和进食均减少，毛色较暗、干枯，对刺激的反应较为迟钝；薯蓣皂苷低、中、高组大鼠全身症状较模型组减轻，但是精神状况一般，食欲和活动力增加，体表毛发光泽较好。

3.2 薯蓣皂苷对RA模型大鼠体质量的影响给药前，与对照组比较，模型组及薯蓣皂苷低、中、高剂量组大鼠体质量明显降低（P＜0.05）。给药第5天、第10天、第15天，与对照组比较，模型组大鼠体质量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，薯蓣皂苷低、中、高剂量组大鼠体质量明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠不同时间段的体质量比较 （±s，g）

表2 各组大鼠不同时间段的体质量比较 （±s，g）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 n 给药前 给药第5天 给药第10天 给药第15天.21±10.16模型组 8 248.09±2.87* 284.26±1.12* 294.70±1.68* 309.49±2.08*薯蓣皂苷低剂量组 8 248.35±2.76* 287.25±2.76＃ 298.65±2.62＃ 315.80±1.96＃薯蓣皂苷中剂量组 8 249.58±3.04* 296.98±3.13＃ 306.55±2.34＃ 328.18±2.13＃薯蓣皂苷高剂量组 8 248.86±1.98* 298.72±2.37＃ 324.48±2.46＃ 393.03±2.55对照组 8 328.33±5.71 374.18±10.52 392.04±12.45 421＃

3.3 薯蓣皂苷对RA模型大鼠关节体积的影响给药前，与对照组比较，模型组大鼠足趾体积明显增大（P＜0.05）。第5天、第10天、第15天，与对照组比较，模型组大鼠足趾体积明显增大（P＜0.05）；与模型组比较，薯蓣皂苷低、中、高剂量组大鼠足趾体积明显减小（P＜0.05）。见图1、表3。

表3 各组大鼠不同时间段的关节体积比较 （±s，mL）

表3 各组大鼠不同时间段的关节体积比较 （±s，mL）

注：对照组比较，*P＜0.05，模型组比较，＃P＜0.05

组别 n 给药前 第5天 第10天 第15天±0.014模型组 8 0.798±0.045* 0.623±0.047* 0.582±0.055* 0.411±0.042*薯蓣皂苷低剂量组 8 0.654±0.058* 0.585±0.059＃ 0.557±0.076＃ 0.361±0.041＃薯蓣皂苷中剂量组 8 0.692±0.053* 0.565±0.015＃ 0.528±0.080＃ 0.334±0.054＃薯蓣皂苷高剂量组 8 0.680±0.088* 0.536±0.024＃ 0.508±0.063＃ 0.313±0.048对照组 8 0.087±0.010 0.121±0.032 0.177±0.011 0.197＃

图1 薯蓣皂苷对CFA诱导关节炎大鼠关节体积的影响

3.4 薯蓣皂苷对RA模型大鼠血清炎性因子水平的影响与对照组比较，模型组大鼠血清IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、COX-2 mRNA、IL-6 mRNA水平显著升高（P＜0.01，P＞0.001）；与模型组比较，薯蓣皂苷低、中、高剂量组大鼠血清IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、COX-2 mRNA、IL-6 mRNA水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），且呈剂量依赖性。见图2。

图2 薯蓣皂苷对RA模型大鼠血清炎症因子的影响

3.5 薯蓣皂苷对RA模型大鼠PGE2表达水平的影响与对照组比较，模型组大鼠血清PGE2水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，薯蓣皂苷低、中、高剂量组大鼠血清PGE2水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈剂量依赖性。见图3。

图3 薯蓣皂苷对RA模型大鼠血清PGE2水平的影响

3.6 对PA模型大鼠踝关节组织病理学改变的影响对照组大鼠关节滑膜平滑完整，结构清晰，无滑膜增生及炎症细胞；模型组大鼠关节结构粗糙，滑膜细胞增生显著，可见大量淋巴细胞浸润并侵入下层软骨；薯蓣皂苷低、中、高剂量组大鼠踝关节炎症及浸润到关节区淋巴细胞的数目减少，且呈剂量依赖性。见图4。

图4 大鼠踝关节组织病理变化（HE染色，×200）

4 讨论

穿龙薯蓣具有祛风湿、活血等功效［2］，主治风寒湿痹、劳损扭伤、痈肿等，临床上主要用于治疗冠心病、抗动脉粥样硬化、降血脂、平喘抗炎、抗肿瘤等［3-8］。而薯蓣皂苷是从穿龙薯蓣中提取出来的一种天然皂苷类化合物，主要成分为水糖性总皂苷，本研究观察其对RA模型大鼠的研究。

RA是一种以关节滑膜慢性炎症为特征的自身免疫性疾病，主要表现为关节疼痛、肿胀和僵硬，出现关节骨和软骨破坏，进而导致不可逆的关节畸形［9］。以CFA诱导的大鼠模型与人RA的病理过程类似，其诱导RA大鼠模型广泛用于研究，组织学特点包括滑膜增生、炎性细胞浸润、软骨及骨组织破坏等特征［10］。研究表明，知母总皂苷可明显改善佐剂型关节炎大鼠改善滑膜增生和炎性浸润［11］。本研究观察到CFA诱导大鼠关节炎后，模型组大鼠出现关节红肿、活动不便，给予薯蓣皂苷后很大程度上缓解大鼠关节肿痛，这与薯蓣皂苷对胶原诱导关节炎模型的作用相近［12-13］，证实了薯蓣皂苷可缓解RA模型大鼠的关节肿痛。但是单用一种动物模型有一定的局限性［14］，应用多种动物模型从不同角度去验证，今后将进一步完善，同时提取人滑膜细胞进一步完善体外实验。

目前RA的发病机制尚不清楚，但已证实炎症反应在RA的病理进程中发挥重要作用。目前已开发出多种针对不同炎症因子的生物制剂，对RA的治疗发挥重要作用，但价格较高［15］。近年来，薯蓣皂苷元免疫调节的作用被逐渐重视［16-18］。穿龙薯蓣总皂苷具有免疫抑制作用。研究表明，穿龙薯蓣皂苷元对RA模型小鼠的Th1和Th17细胞可以产生明显抑制作用，对Th2细胞、Treg细胞有一定的促进作用［19-20］，对胶原诱导小鼠关节炎模型有一定的疗效，可降低血清和关节滑液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，这与本研究结果一致。同时，本实验RA模型大鼠血清中PGE2和COX-2水平明显升高。COX-2为前列腺素合成过程的关键酶，该酶在正常细胞中的含量较低，在TNF-α、IL-1β等炎症因子作用下，其表达会明显升高，PGE2水平也随之增高。COX-2及PGE2已成炎症性疾病及肿瘤治疗的重要的靶分子［21］。本研究结果证实薯蓣皂苷可降低两者水平，明确其对CFA诱导的大鼠模型具有抗炎效应。

本研究发现，RA模型组大鼠滑膜组织中可见大量中性粒细胞浸润；薯蓣皂苷干预后，中性粒细胞浸润减少。提示薯蓣皂苷可能通过影响氧化应激发挥治疗作用。目前认为，RA发病进程中的重要促炎因子IL-1β、TNF-α可通过NADPH氧化酶产生活性氧簇［22］。RA患者的滑膜组织及软骨是一氧化氮的主要来源之一。活性氧簇和活性氮簇相互作用可产生大量活性产物，进而参与RA疾病［23］。目前尚无薯蓣皂苷与氧化应激的研究，我们课题组也将进一步完善研究。

中医药在治疗类风湿关节炎的临床实践中积累了丰富的经验［24-25］，具有良好的应用和开发前景。多成分、多靶点、多途径是中药治疗疾病的特点［26-27］。RA患者的肿瘤发生率、心血管疾病发生率较高，薯蓣皂苷除了明显的免疫调控作用外，同时具有抗肿瘤、降血脂作用，对RA患者的综合治疗很有优势。通过本研究明确薯蓣皂苷对RA的治疗作用，为推进薯蓣皂苷临床研究提供更全面的理论依据。