化腐再生法调控iNOS、IL-1β、CD16的表达促进糖尿病大鼠筋之血化*

孙旭，孙瀚驰，徐强，朱朝军，刘潇鸽，宋子豪，李萌，刘振雷，张朝晖

1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250

糖尿病足破溃经常深达肌腱，且感染会沿着肌腱蔓延，患者被迫截肢甚至失去生命。因此，糖尿病足溃疡中对于肌腱的感染处理是治疗成功与否的关键。临床发现，经化腐再生治疗后，变性但尚未失去活性的肌腱表层上可见散在分布的新生肉芽岛，并逐渐生长，最终暴露的肌腱被新生的肉芽组织覆盖，称之为“筋之血化”［1-2］，经过此过程后创面逐渐愈合。前期的研究发现，筋之血化的出现是建立在糖尿病足创面微环境稳态形成之后，能加速创面愈合［3-7］。在前期研究的基础上，本文通过观察诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、CD16的表达，以期了解筋之血化过程的变化规律，对于提高糖尿病足创面修复水平，丰富中医外治理论提供科学依据。

1 材料

1.1 动物30只SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量（250±20）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-（军）2014-2018，实验伦理审查号：20180929004。动物饲养在温度（20±3）℃，湿度37%～48%，12 h/12 h明暗交替的环境下，正常饮食饮水。

1.2 药物与试剂橡皮生肌膏［药物成分：象皮（制）、血余、龟甲、地黄、当归、石膏、炉甘石、蜂蜡，天津达仁堂京万红药业有限公司，国药准字：Z12020345］；复方菠萝蛋白酶撒布（汕头市橄榄枝制药有限公司，规格：100 g·L-1，国药准字：H44024825）；德湿洁水胶体伤口敷料（德国保赫曼公司，国械注进：20172641570）；医用凡士林油纱条（河南新飘安高科股份有限公司，国械注准：20153640846）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美国Sigma公司，货号：S0130）；注射用青霉素钠［华北制药集团动物保健品有限责任公司，规格：2.4 g（400万单位），兽药字：（2015）030201248］。iNOS、IL-1β、CD16 ELISA试剂盒（加拿大Hermes Criterion Biotechnology公 司，货 号：RH0012、RH0053、RH0026）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，pH 8.0）抗原修复液、EDTA（pH 9.0）抗原修复液（美国Abcam公司，货号：ab128983、ab93680、ab93684）；柠檬酸（pH 6.0）抗原修复液、苏木素染液（美国Abcam公司，货号：ab64214、ab143166）；中性树胶（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9555）；iNOS、IL-1β一抗（美国Abcam公司，货号：ab3523、ab9722）；CD16一抗（美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：MAI-84008）；HRP标记的山羊抗兔鼠通用二抗（美国Agilent公司，货号：K5007）；免疫组化试剂盒（美国Agilent公司，货号：K3468）；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA，北京索莱宝生物科技有限公司，货号：A8020）。

1.3 仪器MULTISKAN MK3型全自动多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；DH4000A型电热恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；ASP300S型全自动组织脱水机、EG1160型一体式石蜡包埋机、RM2235型切片机（德国徕卡仪器有限公司）；E200型双目生物显微镜、ECLIPSE 90i型正置荧光显微镜、NIS-Elements F 2.20成像系统（日本Nikon公司）；MH-1型微型漩涡振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；TD5型低速医用离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）。

2 方法

2.1 造模分组及药物干预大鼠适应性喂养3 d后，以3.5 mg·kg-1的剂量腹腔注射STZ，以3 d后血糖值≥16.7 mmol·L-1为糖尿病模型造模成功。将糖尿病大鼠背部剃毛后，常规消毒，在无菌条件下，用外科方法在大鼠腰背部脊柱两侧制作2个伴肌腱损伤的溃疡创面，取25%的冰醋酸50μL滴到创面上，以溃疡创面形成并伴有2个变性坏死肌腱为肌腱暴露创面模型成功［8］。连续3 d肌注青霉素4万单位预防感染造成死亡。具体造模过程如图1。造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照组、治疗1组、治疗2组、治疗3组，并于次日开始药物干预。模型组应用凡士林油纱外敷，阳性对照组应用水凝胶外涂，治疗1组应用橡皮生肌膏外敷，治疗2组外用菠萝蛋白酶撒布，治疗3组应用橡皮生肌膏外敷联合菠萝蛋白酶撒布，每日换药1次，连续21 d。

图1 造模过程

2.2 ELISA法检测血清中iNOS、IL-1β、CD16的水平分别于治疗3 d、7 d、14 d、21 d后眼眶采血，每次1.5 mL，于抗凝管中混匀，离心半径10 cm，3 000 rpm·min-1离心10分钟，取上清。严格按照ELISA试剂盒说明书操作，应用双抗体夹心法测定大鼠血清中iNOS、IL-1β、CD16的水平。

2.3 免疫组化检测创周组织iNOS、IL-1β、CD16的表达将创周组织做石蜡切片，脱蜡后进行抗原修复，并于阻断内源性过氧化物酶后进行BSA封闭，加入一抗和二抗孵育后，DAB显色，复染细胞核后脱水封片。每组内每张切片随机挑选至少3个视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为阳性判定的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片的积分光密度值（integrated optical density，IOD）及组织的像素面积（AREA），并求出平均光密度值（average optical，AO），AO＝IOD/AREA，AO值越大表明阳性表达水平越高。

2.4 统计学方法应用SPSS 22.0统计学软件对实验数据进行处理，计量数据以均数±标准差（±s）表示。组间比较符合正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析，并用LSD进行检验后多重比较，不满足上述条件的数据选择秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠血清中iNOS的水平ELISA法检测各组大鼠不同时间点血清中iNOS的水平。与模型组比较，治疗3 d后，治疗3组大鼠血清中iNOS的水平显著升高（P＜0.01）；而治疗21 d时，治疗2组和治疗3组大鼠血清中iNOS的水平显著降低（P＜0.05），大鼠血清中iNOS水平的变化趋势与阳性对照组一致，均呈现先升高后降低的趋势。见表1。

表1 各组大鼠血清中iNOS的水平 （±s，ng·L-1）

表1 各组大鼠血清中iNOS的水平 （±s，ng·L-1）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

3 d 7 d 14 d 21 d模型组 6 220.61±22.65 307.21±44.10 351.31±02.07 36组别 n 8.48±49.75阳性对照组 6 466.64±63.02** 575.53±92.36** 651.96±84.16* 266.72±52.97*治疗1组 6 261.52±74.73 311.06±66.92 400.76±79.32 323.23±58.47治疗2组 6 294.80±71.34 330.53±84.90 388.85±81.61 270.83±55.83*治疗3组 6 457.99±80.82** 563.81±80.63** 663.39±38.61** 244.60±46.26**

3.2 各组大鼠创周组织iNOS的蛋白表达水平免疫组化分析各组大鼠创周组织iNOS蛋白在不同时间点的表达情况。与模型组相比，治疗3 d后，治疗3组iNOS免疫组化染色呈深褐色强阳性，且部分连成片状表达，AO值显著增高（P＜0.05），而治疗周期延长后，iNOS蛋白表达水平呈现先升高后降低的趋势，与阳性对照组一致。结果见表2，图2。

图2 治疗3 d后各组大鼠创周组织iNOS蛋白表达的免疫组化染色图（×200）

表2 各组大鼠创周组织中iNOS蛋白的表达水平 （±s，/100）

表2 各组大鼠创周组织中iNOS蛋白的表达水平 （±s，/100）

注：与模型组比较，*P＜0.05

组别 n 3 d 7 d 14 d模型组6 1.78±0.51 3.31±0.41 3.20±0.83阳性对照组6 3.16±0.68 4.51±1.40 2.00±0.31治疗1组 6 2.81±0.50 3.98±1.13 4.43±0.59治疗2组 6 2.12±1.06 3.80±0.65 3.78±1.18治疗3组 6 3.83±1.44*5.28±2.24 2.69±0.44

3.3 各组大鼠血清中IL-1β的水平ELISA法检测各组大鼠不同时间点血清中IL-1β的水平。与模型组比较，治疗3 d后，治疗3组大鼠血清中IL-1β水平显著增高（P＜0.05），而治疗21 d后，治疗3组大鼠血清中IL-1β水平显著降低（P＜0.01），且治疗3组大鼠血清中IL-1β水平的变化趋势与阳性对照组一致。见表3。

表3 各组大鼠血清中IL-1β的水平 （±s，ng·L-1）

表3 各组大鼠血清中IL-1β的水平 （±s，ng·L-1）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

3 d 7 d 14 d 21 d模型组 6 11.19±1.61 13.23±1.62 17.81±2.27 16.47±1.组别 n 52阳性对照组 6 16.56±2.39* 22.21±3.08* 28.33±2.22 10.83±2.36**治疗1组 6 12.80±2.94 17.36±3.53 22.70±2.83* 10.30±1.72治疗2组 6 13.16±2.14 17.80±1.76 22.37±2.54* 9.92±1.52治疗3组 6 16.95±2.65** 21.47±2.36* 28.08±2.49* 10.38±2.39**

3.4 各组大鼠创周组织IL-1β的蛋白表达水平免疫组化分析各组大鼠创周组织IL-1β蛋白在不同时间点的表达情况。与模型组相比，治疗3 d时，治疗3组IL-1β免疫组化染色呈深褐色强阳性，且部分连成片状表达，AO值显著增高（P＜0.05），随着治疗周期延长，IL-1β的蛋白表达水平呈先升高后降低趋势。结果见表4，图3。

图3 治疗3 d后各组大鼠创周组织IL-1β表达的免疫组化染色图（×200）

表4 各组大鼠创周组织IL-1β蛋白的表达水平 （±s，/100）

表4 各组大鼠创周组织IL-1β蛋白的表达水平 （±s，/100）

注：与模型组比较，*P＜0.05

3 d 7 d 14 d模型组组别 n 6 1.48±0.29 2.85±0.61 4.19±2.43阳性对照组6 3.41±1.83 5.28±1.46 1.00±0.68*治疗1组 6 2.12±1.74 4.33±2.97 4.60±0.69治疗2组 6 2.18±0.66 4.14±1.53 3.83±2.31治疗3组 6 3.66±1.22*5.51±2.69 1.59±0.45

3.5 各组大鼠血清中CD16的水平ELISA法检测不同时间点各组大鼠血清中CD16水平。与模型组比较，治疗3 d后，治疗3组大鼠血清中CD16水平显著增高（P＜0.05），而治疗21 d时，治疗1、2、3组大鼠血清中IL-1β水平显著降低（P＜0.05），且治疗3组大鼠血清中CD16水平的变化趋势与阳性对照组一致。见表5。

表5 各组大鼠血清中CD16的水平 （±s，ng·L-1）

表5 各组大鼠血清中CD16的水平 （±s，ng·L-1）

注：与模型组比较，*P＜0.05

组别 n 3 d 7 d 14 d 21 d模型组 6 60.20±13.60 79.45±13.01 95.31±10.46 98.00±16.26阳性对照组 6 82.97±13.91* 115.35±17.01** 153.13±8.26** 58.46±13.69*治疗1组 6 68.47±9.19 94.90±17.10 120.70±15.08 73.78±18.94*治疗2组 6 68.07±16.20 101.09±3.95 121.58±11.08 68.60±27.39*治疗3组 6 80.31±9.49* 117.12±13.84** 156.32±11.99** 58.90±15.73*

3.6 各组大鼠创周组织CD16蛋白表达水平免疫组化分析各组大鼠创周组织CD16蛋白在不同时间点的表达情况。与模型组相比，治疗3 d时，治疗3组大鼠创周组织免疫组化染色呈深褐色强阳性，AO值显著增高（P＜0.05），随着治疗周期延长，CD16蛋白表达水平呈先升高后下降的趋势。见表6，图4。

表6 各组大鼠创周组织CD16蛋白的表达水平 （±s，/100）

表6 各组大鼠创周组织CD16蛋白的表达水平 （±s，/100）

注：与模型组比较，*P＜0.05

3 d 7 d 14 d模型组组别 n 6 0.98±0.29 1.81±0.48 3.31±2.54阳性对照组 6 2.20±0.81*4.70±1.96 0.84±0.55治疗1组 6 1.70±0.60 3.22±1.28 4.65±2.03治疗2组 6 1.39±0.35 2.74±1.38 3.64±0.80治疗3组 6 3.41±2.04*4.89±3.54 1.60±0.29

图4 治疗3 d后各组大鼠创周组织CD16表达的免疫组化染色图（×200）

4 讨论

糖尿病足是糖尿病严重的并发症之一［9］。由于皮肤修复能力受损、局部微循环较差、有效治疗滞后等原因，病原体和病原微生物逐步侵袭周围组织。当感染沿着肌腱蔓延时，会向肢体近端发展，使得创面在短时间内进一步扩大，毒素大量生成并入血，患者被迫截肢甚至威胁生命［10-14］。因此，在糖尿病足的治疗中，肌腱感染的处理尤为重要。大量的临床实践发现，在肌腱变性坏死早期，应用化腐再生法，即菠萝蛋白酶靶向去除坏死肌腱及组织，结合橡皮生肌膏创造湿性愈合环境，可有效控制感染蔓延，促进肉芽和皮肤组织原位再生。治疗早中期会刺激机体产生炎症及免疫反应，诱发巨噬细胞产生和释放炎症因子，而本研究主要观察iNOS、IL-1β、CD16等因子在筋之血化过程中的表达。

创面修复是个复杂的动态过程，炎症反应是第一阶段。巨噬细胞作为体内重要的吞噬和抗原呈递细胞，在机体处理外源性病原微生物方面发挥重要作用，是创伤愈合和组织修复过程的“总指挥”［15］。M1型（经典活化型）巨噬细胞在早期分泌大量炎症因子和炎症趋化因子，预防细菌的侵入，吞噬清除表面的坏死组织及病原体，以加速创面炎症反应进程［16］。而在创伤后期主要以M2型（替代活化型）巨噬细胞主导，促进组织的修复［17］。因此，巨噬细胞促使炎症期向增殖修复期过渡的过程，被认为是伤口愈合的重要防线［18］。

iNOS是一氧化氮合酶的亚型，主要在炎性细胞及成纤维细胞中表达。在氧化应激反应中iNOS表达增加，一氧化氮（nitric oxide，NO）通过iNOS释放，抑制浸润肉芽肿参与炎症反应，调节胶原形成［19-20］。本实验结果表明，早期时治疗3组大鼠血清中iNOS的水平明显升高，并呈现不断增长的趋势，至治疗21 d后，iNOS的水平明显下降。免疫组化结果同样显示，iNOS蛋白在早期高表达，而后期出现下降趋势，表明化腐再生法促使iNOS的表达和释放在早期出现，缩短免疫调控进程，后期抑制iNOS的产生和释放。

IL-1β作为炎症反应中免疫介导因子之一，也是伤口愈合的重要介质［21］。它主要由单核巨噬细胞产生，可诱导巨噬细胞向促炎表型M1型转化［22］。IL-1β在正常生理条件下基本不表达，但在损伤组织中高表达［23］，此时IL-1β分泌到细胞外，诱发并放大炎性反应［24］。在本实验中，早期时，治疗3组大鼠血清中IL-1β的水平明显升高，至治疗21 d时，IL-1β的水平明显下降。免疫组化检测发现，治疗3组大鼠创周组织IL-1β蛋白同样呈现早期高表达，而后期出现下降趋势，提示IL-1β在早期可介导局部抗炎，参与免疫反应，吞噬及清除坏死组织。推测，化腐再生法可以促使IL-1β分泌，调控免疫反应。

CD16是自然杀伤细胞常见的表面标记之一，属于免疫球蛋白超家族成员，具有连接体液免疫和细胞免疫的桥梁作用［25］。CD16通过调动炎症细胞和活化受体趋化因子加强炎性反应［26］。研究表明，CD16可以启动中性粒细胞的吞噬作用，避免炎症扩散［27］。本研究结果显示，治疗早期，治疗3组大鼠血清中CD16的水平呈现逐渐升高的趋势，在治疗21 d时CD16的水平明显下降。免疫组化结果显示，创周组织CD16的蛋白表达同样以早期高表达为主。推测化腐再生法在免疫反应的早中期可针对性提高CD16活性，促进免疫炎症反应进程。

化腐再生法主要药物为橡皮生肌膏和复方菠萝蛋白酶。既往研究表明，橡皮生肌膏是良好的免疫促进剂，外用对巨噬细胞有明显的激活和吞噬作用［28-29］。菠萝蛋白酶作为酶类清创剂的一种，具有一定的抗炎作用，在体外能针对性地激活巨噬细胞，二者协同维持创面的微环境稳态，靶向作用于坏死肌腱与筋膜，促进肉芽组织生长，出现“筋之血化”，为创面修复提供必要环境［30］。通过本研究发现，化腐再生法通过局部药物的复合外用，使M1型巨噬细胞因子iNOS、IL-1β、CD16在早中期针对性地高表达，加快炎症反应进程，为后期组织重塑提供基础。

综上，通过观察免疫炎性因子iNOS、IL-1β、CD16在糖尿病溃疡创面不同时间的作用规律，提示化腐再生法具有双重调节作用，调控糖尿病溃疡创面筋之血化过程，为中医药互补外科清创治疗，加快糖尿病溃疡的筋之血化进程以促进创面愈合提供依据。