食品中硼酸测定标准曲线制作注意事项探究

◎ 魏文强，李亚平

（通渭县食品药品检验检测中心，甘肃 通渭 743300）

硼酸是一种含硼化合物，硼酸曾广泛作为食品添加剂用于面制品、肉制品、水产品中，硼元素也是人体必需的微量元素，但是硼含量超过限量时，会对人体造成不同程度的毒害[1-4]，成人每日允许最大摄入的硼含量为 0.3 mg·kg-1·d-1[5]，原卫生部在 2008 年发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》明确禁止硼酸在食品中添加，即任何食品中不得检出[6]。目前，我国食品中硼酸的检测方法依据《食品安全国家标准 食品中硼酸的测定》（GB 5009.275—2016），本方法通过乙基己二醇-三氯甲烷溶液对食品中的硼酸进行富集，再用姜黄素-冰乙酸对食品中硼酸进行显色，溶液颜色的深浅与所测定食品中的硼酸含量成正比，可以通过紫外分光光度计定量测定食品中的硼酸[7]。在整个测定过程中，对标准曲线绘制尤为重要，其直接能够影响到最终食品测定结果的准确与否，但在实际食品中硼酸的测定过程中经常出现标准曲线线性不好，相关系数R值达不到实验室要求的问题，为探究导致以上问题的原因，提高工作效率，本文按照试验步骤，分析总结试验测定过程中的注意事项。

1 材料与方法

1.1 试剂

硼酸标准溶液（5 μg·mL-1）、无水乙醇（分析纯）、2-乙基-1,3-己二醇（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、冰乙酸（分析纯）、姜黄色素、三氯甲烷（分析纯）、浓硫酸（分析纯）和蒸馏水。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计（UV8000s），购自上海元析仪器有限公司；电子天平（Quintix224-1CN，感量0.1 mg），购自德国赛多利斯科学仪器有限公司；涡旋振荡器（HD-2500），购自杭州佑宁仪器有限公司。

1.3 试验方法

（1）准确吸取硼酸标准溶液（5 μg·mL-1）0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL于25 mL塑料试管中，各加水至5 mL。加硫酸溶液（1+1）1 mL，振荡混匀，加EHD-CHCl3溶液5.00 mL，盖上盖子，涡旋振荡器振摇2 min，静置分层，吸取下层的EHDCHCl3溶液并通过φ7 cm干燥快速滤纸过滤。

（2）各取1.00 mL过滤液于50 mL塑料试管中，依次加入姜黄-冰乙酸溶液1.0 mL，硫酸0.5 mL，摇匀，静置30 min，加无水乙醇25 mL，静置10 min，于550 nm处1 cm比色皿测定吸光度。以标准系列的硼酸含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 姜黄色素溶解效果对标准曲线线性的影响

分别选用未经超声溶解的姜黄素-冰乙酸和经超声促进溶解的姜黄素-冰乙酸作为显色液，其他试剂和试验条件保持一致进行标准曲线的测定，测定结果见表1。未经超声溶解的姜黄素-冰乙酸作为显色液，做出的标准曲线线性和R2值均比经超声促进溶解的姜黄素-冰乙酸作为显色液所绘制的标准曲线差。所以在姜黄色素较难溶解的情况下，可以先加适量的冰乙酸，超声促进溶解，然后再定容至100 mL，以保证标准曲线的线性关系良好。

表1 使用不同溶解效果的姜黄素显色后的吸光度值表

2.2 2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液配制时间对标准曲线线性的影响

为了验证2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液放置时间的长短对标准曲线线性的影响，在其他试剂和试验条件保持一致的情况下，选用现用现配的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液和提前配制好，但已经放置了12 h、24 h的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液进行标准曲线的测定，结果见表2。使用不同配制时间的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液对标准曲线的线性影响较大，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液放置时间过久会造成标准曲线的线性较差，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液应现用现配。

表2 使用不同配制时间的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液显色后的吸光度值表

2.3 试验过程中使用的浓硫酸的开启时间对标准曲线线性的影响

硼酸测定过程中长时间使用同一瓶的浓硫酸，由于浓硫酸易吸水，会造成浓硫酸的浓度下降，为了验证试验过程中所使用的浓硫酸开启时间对标准曲线线性的影响，在其他试剂及试验条件保持一致的情况下，使用相同品牌、同一批次但打开时间不同的浓硫酸，进行标准曲线的测定，结果见表3。使用相同品牌、同一批次但打开时间不同的浓硫酸对标准曲线的线性影响较大，使用打开时间越长的浓硫酸，显色反应颜色会越浅，标准曲线的线性也会更差，造成最终的检测结果不准确。

表3 使用开启时间不同的浓硫酸显色后的吸光度值表

2.4 含有2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液的不同容积的塑料试管对硼酸富集、萃取效果的标准曲线线性的影响

《食品安全国家标准 食品中硼酸的测定》（GB 5009.275—2016）中5.2要求吸取硼酸标准系列溶液于25 mL塑料试管中，然后进行后续操作。但在实际试验过程中发现，相较于25 mL的塑料试管，选用50 mL的塑料试管做出的标准曲线线性更好，这可能是因为塑料试管容量变大，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液对硼酸富集、萃取效果变好。为了验证该因素的影响，在其他试剂及试验条件保持一致的情况下，分别选用50 mL塑料试管、25 mL塑料试管，进行标准曲线测定，结果见表4。选用50 mL的塑料试管富集、萃取硼酸做出的标准曲线线性优于选用25 mL的塑料试管。选取50 mL的塑料试管可以使2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液与标准系列溶液混合更为均匀，对硼酸的富集、萃取更为有效，标准曲线的线性更好。

表4 选用不同容积规格塑料试管富集、萃取硼酸后的吸光度值表

3 结论

分光光度法测定食品中硼酸的测定步骤较为复杂，在硼酸标准曲线的制作过程中应注意以下几点。

（1）姜黄素-冰乙酸溶液作为显色溶液，对标准曲线的线性有很重要的影响，在配制过程中姜黄色素较难溶解，可以先加适量的冰乙酸，超声促进溶解，然后定容至100 mL，此溶液也必须保存于塑料容器中，因为在强酸条件下，含硼酸盐的玻璃器皿不稳定，可以将硼酸盐转化为硼酸溶液，使用塑料容器可以避免带入外源性的硼。

（2）2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液因为含有三氯甲烷，三氯甲烷在光照下不稳定，放置时间过长，导致硼酸标准系列梯度不明显，标准曲线线性不好，相关系数R值达不到实验室要求，因此，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液要现配现用。

（3）试验过程中所使用的浓硫酸易吸水而导致浓度下降，反复使用，会使最后的显色反应梯度不佳，最终造成标准曲线的线性不好、相关系数R值达不到实验室的要求，所以应保证浓硫酸的密封性，或者尽量使用新打开的浓硫酸。

（4）选用50 mL的塑料试管做出的标准曲线线性优于选用25 mL的塑料试管，最终做出的标准曲线线性良好，相关系数R值普遍能达到0.99以上，符合实验室的要求，所以建议将标准溶液系列加入到50 mL的塑料试管中，之后再进行后续操作，以提高检测结果的准确性。