芒果叶总黄酮的提取工艺研究

◎ 莫阳丽，刘燕丽，梁伟权，张开平

（百色学院 农业与食品工程学院，广西 百色 533000）

芒果（Mangifera indicaL.）属于仙人掌漆树科杧果属，是世界上最受欢迎的热带水果之一[1-2]。芒果叶作为芒果的副产品，其富含黄酮类化合物、芒果苷、槲皮素、奎尼酸、山奈酚等多种活性成分[3-5]。芒果叶味酸、甘，性凉、平，具有平喘止咳祛痰[6]、免疫抗炎镇痛[7-8]、保肝利胆、降血糖[9]和抗氧化[10]等药理作用，还具有行气疏滞、去瘀积的功效，可用于热滞腹痛、气涨、小儿疳积、消渴等症状[11-12]。黄酮类化合物具有抗菌、抗癌、抗氧化等生理功能，可用于治疗骨质疏松症和糖尿病[13-14]。目前，关于芒果叶黄酮类化合物的研究鲜有报道。芒果叶作为百色优势资源，具有较大的医药应用开发价值。本实验通过优化芒果叶总黄酮的提取条件，旨在为芒果叶资源的进一步开发利用提供有效的技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

ZT-1000A高速多功能粉碎机：永康市展帆工贸有限公司；SHZ-Ⅲ循环真空水泵：上海亚荣生化仪器厂；L6S紫外可见分光光度计：成都川弘科生物技术有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司。

1.2 材料与试剂

芒果叶：百色市右江区台农；芦丁：江西佰草源生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、过氧化氢、水杨酸等均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 芦丁标准曲线绘制

参照亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法[15]。精确取浓度为0.10 mg·mL-1的0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL芦丁标准溶液，置于10 mL容量瓶中。分别加入0.50 mL的5% NaNO2溶液，摇匀静置6 min；加入0.50 mL的10% Al（NO3）3溶液，摇匀静置6 min；加入4.00 mL浓度为4% NaOH溶液，再用75% C2H5OH溶液定容，放置15 min，于510 nm波长处测吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。

1.3.2 提取工艺流程

芒果叶→清洗→烘干（65 ℃）→粉碎→过筛（100目）→乙醇浸渍→真空抽滤→抽提液。

选取新鲜、没有腐败、无损伤的芒果叶，洗净、沥干，65 ℃下烘干，粉碎，过100目筛，密封保存备用。

在50 mL碘量瓶中准确称取2 g芒果叶粉末，加入75%乙醇溶液，在60 ℃恒温水浴锅中水浴2 h后，真空抽滤，将滤液定容至50 mL容量瓶；在25 mL容量瓶中加入1 mL样品溶液，加入0.5 mL的5% NaNO2溶液，振摇后放置6 min；加入0.5 mL 10%Al(NO3)3溶液，振摇后搁置6 min；加4% NaOH溶液4.00 mL，再加入75%乙醇定容，搁置15 min。在510 nm处测定吸光度值，并计算样品中黄酮类物质得率：

式中：C为芒果叶中黄酮提取液的浓度（mg·mL-1）；N为稀释倍数；V为芒果叶黄酮提取液的体积（mL）；M为芒果叶粉质量（g）。

1.3.3 单因素实验

选取提取时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、料液比（1∶20、1∶ 25、1∶30、1∶ 35、1∶40）、乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、提取温度（60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃）4个因素，每个因素取5个水平，每个水平重复3次，按照“1.3.2”所述的基本步骤，研究各个因素对黄酮类物质得率的影响，实验数据采用SPSS statistics 18软件进行方差分析，结果用平均值±标准偏差来表示。

1.3.4 正交实验

为了确定芒果叶黄酮类物质提取的最优条件，以黄酮得率为指标，根据单因素实验的结果分析，选取提取时间、料液比、乙醇浓度和提取温度4个因素进行L9(34)正交实验，因素与水平设计见表1。

表1 因素水平设计表

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取时间对芒果叶黄酮得率的影响

由图1可知，芒果叶提取液中的黄酮得率随着提取时间的增加先上升后下降。提取时间为2 h时，黄酮类物质的得率最高；提取时间超过2 h时，黄酮类物质得率明显降低。可能的原因是长时间浸提，部分乙醇挥发，沸点增大，从而导致部分黄酮类化合物遭到破坏，使得黄酮得率下降。因此，选择提取时间为2 h。SPSS软件方差分析表明提取时间对芒果叶黄酮得率的影响显著（P＜0.05）。

图1 提取时间对芒果叶黄酮得率的影响图

2.1.2 料液比对芒果叶黄酮得率的影响

从图2可以看出，随着料液比增加，芒果叶提取液中的黄酮类物质得率逐渐增加。当料液比小于1∶30时，黄酮类物质得率增幅较大；料液比大于1∶30时，黄酮类物质得率增加缓慢，说明乙醇剂量加大，有助于芒果叶中黄酮类物质彻底溶出，但考虑提取成本，确定料液比为1∶30。SPSS软件方差分析表明料液比对芒果叶黄酮得率的影响显著（P＜0.05）。

图2 不同料液比对芒果叶黄酮得率的影响图

2.1.3 乙醇浓度对芒果叶黄酮得率的影响

由图3可知，芒果叶提取液中黄酮类物质得率随着乙醇浓度的增加先增加后下降。当乙醇浓度为50%～70%时，芒果叶中黄酮类物质容易溶出，黄酮得率不断升高；继续增加乙醇浓度，一些脂溶性物质和色素浸出，黄酮类物质得率显著下降，并且这些物质将与黄酮类物质竞争溶剂，影响黄酮类物质溶出。因此，乙醇浓度的选择为70%。SPSS软件方差分析表明乙醇浓度对芒果叶黄酮得率的影响显著（P＜0.05）。

图3 乙醇浓度不同对芒果叶黄酮得率的影响图

2.1.4 提取温度对芒果叶黄酮得率的影响

由图4可知，芒果叶提取液中黄酮类物质得率随着温度的升高先增加后下降。温度升高加快分子的扩散运动，有助于芒果叶中醇溶性杂质溶出。高温也会使一些可溶性蛋白变性，增加溶液的黏度，使黄酮得率降低。因此，选取最合适的提取温度为65 ℃。SPSS软件方差分析表明提取温度对芒果叶黄酮得率的影响显著（P＜0.05）。

图4 提取温度对芒果叶黄酮得率的影响图

2.2 正交实验

根据表1选取的因素和水平进行正交实验，结果见表2。由表2可知，芒果叶黄酮类物质提取的最优方案为A2B2C2D3，即提取时间为2 h，芒果叶与乙醇的比例为1∶30，乙醇浓度为70%，提取温度为70 ℃。由极差分析表明，影响黄酮得率因素主次顺序为C＞D＞A＞B，即乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞料液比。

表2 正交试验结果与分析表

2.3 验证实验

将正交实验优选工艺A2B2C2D3和实验设计中的最优组合A2B1C2D3分别重复3次实验，其中A2B2C2D3工艺的黄酮得率为（4.87±0.08）%，而A2B1C2D3工艺的黄酮得率为（5.02±0.06）%。通过差异显著性分析（P<0.05），说明这两种提取工艺差异性显著。因此，选择芒果叶黄酮类物质提取的最佳工艺组合为A2B1C2D3，即提取时间为2 h，芒果叶与乙醇的比例为1∶25，乙醇浓度为70%，提取温度为70 ℃。

3 结论

黄酮类化合物种类繁多，且理化性质差别大，同一原料采用不同提取方法，提取的黄酮类化合物差别较大。目前，黄酮类物质的提取方法主要有乙醇加热回流法、超声波法和微波辅助法等[9]。张帆等[15]对比乙醇加热回流法和超声波法提取芒果叶中的黄酮类物质，结果超声波法提取法的黄酮得率低于乙醇加热回流法。本实验通过正交实验获得芒果叶黄酮类化合物的最优提取工艺参数为：提取时间为2 h，芒果叶与乙醇的比例为1∶25，乙醇浓度为70%，提取温度为70 ℃，在此条件下，芒果叶中黄酮得率为5.02%。

我国芒果种植区域广，芒果叶资源丰富、价格低廉、四季可采。黄酮类化合物具有抗脂肪氧化、抗衰老、抗菌、治疗心脑血管疾病等功效。因此对芒果叶黄酮类化合物进行研究，充分利用芒果叶植物资源，变废为宝，可为芒果叶的深加工与保健类产品研发提供支持。