维生素C对PM2.5染毒大鼠肺组织氧化损伤的影响

韩书芝 李海月 张凤蕊 曹磊 平芬

(1河北省人民医院老年病三科，河北 石家庄 050051；2承德医学院附属医院呼吸科)

可吸入颗粒物(PM)中的细颗粒物(PM2.5)已被公认是对人体健康危害最大且代表性最强的大气污染物〔1〕。PM2.5污染的主要原因是能源部门的煤炭燃烧、机动车尾气排放、大规模基础设施建设和居民生活燃料的燃烧。颗粒物由多环芳烃(PAHs)和重金属等一些有害成分组成，对人体多个器官造成损害〔2〕。有学者表明，由于PM2.5具有直径小、表面积大，在空气中长时间悬浮，易于吸附空气中其他有害物质等特点，PM2.5携带的铅、锰、铝、铜等重金属，可在呼吸暴露后进入循环，选择性地在血液、脑、肝、肺等靶器官中积累，对机体造成损伤，且这种损伤具有显著的量效关系〔3〕。因此探索PM2.5的损伤机制，为雾霾所致疾病的防治提供有效的措施，具有重要临床意义。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择雄性Wistar大鼠40只，体重150～200 g，由河北医科大学实验动物中心提供，饲养于医院临研中心动物房。

1.2实验动物分组 将大鼠随机分为5组，每组8只：空白对照组(C组)：不予任何处理。生理盐水对照组(NS组)：给予气管内滴入生理盐水(1 ml/kg)，每周1次。PM2.5染毒组(PM2.5组)：给予气管内滴入浓度为 7.5 mg/ml的PM2.5溶液(1 ml/kg)，每周1次。维生素C低剂量组(LVC组)：染毒同PM2.5染毒组，染毒同时给予10 ml/kg 的维生素C 溶液(浓度为10 mg/ml)灌胃，每天1次。维生素C高剂量组(HVC组)：方法同LVC组，维生素C浓度为30 mg/ml。实验时间共4 w，各组大鼠均自由进食水，实验结束后处死动物。

1.3标本留取 用10%水合氯醛(4 ml/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉成功后抽取腹主动脉5 ml，分离血清，-80℃ 保存待测。抽血后处死大鼠，手术暴露出气管，行左肺灌洗，每次抽取5 ml 4℃ 预冷的1×磷酸盐缓冲液(PBS)注入左肺，回吸得到灌洗液，重复3次，将收集的灌洗液混匀，4℃离心后，取上清-80℃保存。取下右下肺，甲醛固定，制作石蜡包块，切片、苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理变化。余肺、肺泡灌洗液上清，-80℃保存。

1.4肺泡灌洗液中蛋白含量测定 肺泡灌洗液中蛋白含量采用二喹啉甲酸(BCA)法进行测定，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5血清胆红素的测定 采用化学氧化酶标法检测大鼠血清中总胆红素(TBIL)和直接胆红素(DBIL)含量，严格按照试剂盒说明书进行操作，间接胆红素(IBIL)=TBIL-DBIL。

1.6血红素氧化酶(HO)-1、红系衍生的核转录相关因子(Nrf)2肺组织中的表达 采用免疫组化方法测定肺组织中HO-1、Nrf2 的表达，镜下观察到细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒可判定为阳性结果。同时检测HO-1和Nrf2的灰度值，灰度值越大，代表表达越低。

1.7统计方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD检验。

2 结 果

2.1大鼠肺组织病理改变 光镜下观察，C组和NS组大鼠肺泡结构完整，间质无水肿，未见明显炎症细胞浸润。PM2.5组大鼠肺泡间隔增厚或断裂，肺泡有融合，肺间质水肿，可见出血、炎性细胞浸润。LVC组和HVC组大鼠肺组织镜下改变较PM2.5组大鼠较轻。见图1。

图1 各组肺组织HE染色(×100)

2.2大鼠肺泡灌洗液中蛋白含量变化 PM2.5组肺泡灌洗液中蛋白含量明显高于C组和NS组(P<0.05)；LVC组和HVC组蛋白含量较PM2.5组低，差异有统计学意义(P<0.05)；HVC组低于LVC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠血清中各指标含量的变化 PM2.5组与NS组和C组比较，TBIL、IBIL水平均明显降低(P<0.05)，维生素C干预后血清TBIL、IBIL水平较PM2.5组明显升高(P<0.05)，但不同剂量维生素C组间无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.4各组大鼠肺组织Nrf2、HO-1表达 光镜下，PM2.5组胞质中棕黄色及棕褐色颗粒表达减少，C组及NS组、LVC组及HVC组胞质中棕黄色及棕褐色颗粒表达较PM2.5组增加。PM2.5组HO-1、Nrf2灰度值较C组及NS组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，维生素C干预后上述指标灰度值下降，与PM2.5组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但不同剂量维生素C干预组间差异无统计学差异(P>0.05)。见表1、图2、图3。

表1 各组肺泡灌洗液中蛋白及血清中各指标含量及HO-1、Nrf2灰度值比较

图2 HO-1免疫组化镜下观察染色结果(HE，×400)

图3 Nrf2免疫组化镜下观察染色结果(HE，×400)

3 讨 论

目前，环境污染是导致全球过早死亡和残疾的最大原因〔4〕。PM2.5是对全球公共健康构成最大威胁的主要空气污染物〔5〕。据《GBD 2015》估计，环境暴露于PM2.5导致420万人死亡和1.031亿人劳动力损失，占全球死亡率的7.6%和劳动力总损失的4.2%〔6〕。空气污染的急性影响反映在更多的呼吸道症状、心血管事件增加、住院率和死亡率上。而长期影响包括儿童和青少年的肺生长发育迟缓、成人肺功能下降、心血管疾病和肺癌〔7〕。相关研究表明，PM2.5会增加呼吸系统疾病的风险，包括哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)及肺纤维化〔8，9〕。

颗粒物由多环芳烃和重金属等一些有害成分组成，可通过不同机制刺激机体产生活性氧(ROS)，对体内的脂质、脱氧核糖核酸和蛋白质等生物大分子造成氧化损伤〔10，11〕。

研究认为，PM2.5导致死亡率升高的病理机制主要体现在以下几个方面：①PM2.5与氧化应激；②PM2.5与炎症损伤；③PM2.5与核酸修复；④PM2.5与免疫反应〔12〕。氧化应激是机体内氧化剂过量和(或)抗氧化剂减少引起的正常氧化/抗氧化失衡，可以被定义为ROS的产生与抗氧化防御系统对ROS的消耗相比，是一种不平衡的过剩状态，在许多人类疾病的病理生理中起着重要作用，是多系统多器官氧化损伤的共同基础，也是PM2.5引发的疾病发生、发展和恶化的关键，近年来研究证实，急性PM2.5暴露引起的炎症和氧化应激损伤可影响全身多个器官〔13，14〕。

呼吸系统作为机体的重要屏障之一，在PM2.5入侵和破坏全身的过程中起着重要作用。空气污染后最早出现肺部炎症反应和氧化应激，该反应可能驱动凝血系统、心血管系统及全身炎症反应和氧化应激的变化〔15〕。PM2.5随吸气气流被吸入肺部后不仅可沉积在肺部，还能够透过肺泡壁进入到血液循环中，对全身多个器官造成危害。本实验结果提示PM2.5可增加肺毛细血管的通透性，维生素C可降低肺毛细血管的通透性。

Nrf2是氧化应激反应中调节抗氧化防御系统的关键转录因子，在保持细胞氧化还原平衡方面起着关键作用，它调控还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、醌氧化还原酶(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)和HO-1等抗氧化酶的表达〔16，17〕，增加抗氧化酶的活性，进一步清除 ROS 和减轻细胞损伤。

HO-1是一种可诱导的抗氧化酶，在各种细胞中发挥着细胞保护作用，它的水平主要由抗氧化反应元件(ARE)调节。它是通过激活Nrf2而表达的。HO-1在大多数细胞中是由氧化和炎症信号诱导的〔18〕。HO-1催化血红素降解产生一氧化碳、游离铁和胆绿素，后者转化为胆红素，这在很大程度上是HO-1保护作用的原因〔19〕。HO-1表达的调节现在被认为是多种疾病的治疗靶点。

Nrf2/HO-1信号通路是肺内重要的抗氧化途径。PM2.5暴露可使其表达受抑制，并诱导ROS的产生。导致细胞生理生化及代谢功能发生障碍，进而引起脏器组织损伤〔20，21〕。本实验结果推断气管内滴入PM2.5染毒，由于强刺激可能导致了Nrf2/HO-1信号通路的受损，抑制其功能的正常发挥，维生素C干预后Nrf2/HO-1信号途径表达增强，从而发挥有效的抗氧化作用。维生素C是一种水溶性抗氧化剂，其抗氧化作用依靠可逆的脱氢反应来完成，对自由基具有很强的清除能力，可保护机体免受氧化损伤所导致的急慢性疾病的发生及进展〔22〕。另一方面，维生素C可增加葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶缺乏的个体溶血的风险，增加肾结石的发病率，和铁剂同用有增加铁剂体内蓄积〔23〕。鉴于维生素C 对机体影响的双重作用，选择合适的剂量尤为重要。本实验结果也提示低剂量维生素C对PM2.5引起的氧化损伤已具有保护作用。PM2.5通过多种途径对肺脏造成损害，氧化损伤作为主要途径之一备受关注，但其确切机制仍有待进一步深入研究。