运动+热量限制对大鼠骨骼肌质量的影响及Akt、mTOR的作用

王今越 王小虹 冯维斗

(1佛山科学技术学院，广东 佛山 528000；2东北师范大学体育学院；3吉林省体育科研所)

运动是治疗慢性病的良药，在抑制和缓解炎症、心血管病症、胰岛素抵抗、某些癌症、免疫失调、神经病变、增龄性认知下降及肌肉流失等均有卓异表现，而热量限制(CR)有类似作用〔1～4〕。实践中，二者并非总是单独应用，联合实施模式早已广泛应用于国内外中老年人减肥、2型糖尿病的控制〔1，5〕。而一些重量分级项目(格斗项目与举重等)和腾跃技巧类项目(体操、蹦床、跳水和花样滑冰等)的运动员训练期中也要严格执行CR来获取竞赛规则及生物力学方面的优势〔6〕。尽管应用如此广泛，理论方面对运动+CR的了解并不深入，这不仅限制了该潜力模式的进一步优化，也忽视了其潜在的危险。

肌肉健康是老年病学和运动学的关注热点。运动+CR对肌肉的影响和机制报道很少〔7〕，迄今仅有几个报道〔8～10〕研究很孤立，不能互相佐证，无法很好地解释联合模式在调控肌肉健康方面作用。

合成代谢是成体肌肉再生、修复与重塑的基础。介导合成代谢的丝氨酸苏氨酸激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)通路是影响肌肉健康的关键因素，对肌肉肥大和肌量维持有重要意义。机制上，Akt磷酸化Akt1底物(Akt1s1)，解除其对mTOR的抑制，促其激活下游的核糖体40 s小亚基S6蛋白激酶(p70S6K)最终启动mRNA 5′端的翻译。mTORC也会活化并磷酸化重组人翻译起始因子4E结合蛋白(4E-BP)1，参与形成真核起始因子(eIF)4E复合物，启动翻译并编码细胞周期调节蛋白。规律的运动，特别是抗阻运动会激活该通路，介导肌肉生长发育，而CR对Akt、mTOR的作用存在争议〔1，11〕。本研究以此为切入点，调查Akt、mTOR在运动和(或)CR干预骨骼肌质量中的作用。

1 材料和方法

1.1动物和分组 清洁级雄性9 w、280～350 g wistar大鼠30只(吉大实验动物中心，SCXK吉2011-0004)，适应性笼养3 d(全程独笼饲养)，期间自由进食。称重后(初始体重)，随机分组。对照组(C 组):笼养8 w,自由进食与饮水。 运动训练组(T 组):自由进食与饮水。 训练方案：前 3 d 为适应性训练,首日与次日,3% 体重负荷(尾根部缠绕的铅丝,以橡皮筋固定)、游泳 30 min,每天上午、下午各 1 次,第 3 日改为 6% ,其余同上。 从第 4 日至第 8 周结束为正式训练,8% 体重负荷、游泳约 60 min、每天 1 次、每周训练 6 d,周日休息。 游泳过程若出现力竭(水下10 s不能上浮),休息约2 min继续训练。热限组(R组):笼养 8 w,第 1 周前 4 d 按对照组上周平均进食量 80% (即-20%)给食,随后开始按-40% 给食(每周按上一周对照进食量均数校正),直到 8 w 结束。 运动训练+热限组(T+R 组):训练方案同 T 组,饮食方案同 R 组。T和T+R组分配9只大鼠，各有2只无法完成训练方案淘汰，C、R组分配6只大鼠。全过程国家标准啮齿类动物常规饲料喂养、饲养环境为温度23℃，湿度40%～60%、昼夜12 h光照、黑暗循环。每天下午六点提供食物。方案执行首日为周一，塑钢游泳池长、宽、高为100 cm×50 cm×60 cm，水深50 cm，水温保持在(31±2)℃。初始训练负荷以初始体重校正，其后以每周日重新称重，校对下1 w负荷。

1.2样本采集 为避免急性训练效果，所有样本在最后1次训练结束36～48 h后采集。大鼠测量体重后，腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(0.2 ml/100 g.bw)，麻醉后，以断颈椎方式处死(处死前12 h禁食)，取右后腿，用4℃预冷的生理盐水清洗，去除血污，滤纸吸干水分，称重后切分成数段，锡箔纸包裹，做好标签，浸入液氮30 min后放入-80℃超低温冰箱冷冻待测。

1.3主要试剂 Akt丝氨酸473磷酸化〔p-Akt (Ser473)〕抗体、p70S6K苏氨酸389磷酸化〔p-p70S6K(Thr389)〕抗体，细胞信号公司(波士顿，美国)，二抗及其他试剂，碧云天(南京，中国)。

1.4Western印迹检测肌肉蛋白含量 取50 mg腓肠肌放入小烧杯中，加入1 ml提前预冷的匀浆介质〔210 mmol/L甘露醇，70 mmol/L蔗糖，5 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.5 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，10 mmol/L氟化钠(NaF)，pH 7.5〕，剪碎肌组织，去除结缔组织、脂肪等。电动匀浆，转速1 500～1 800 r/min，使组织匀浆化。匀浆液倒入离心管，12 000 g 4℃离心5 min；吸取上清即总蛋白样品，BCA法测蛋白浓度，换算成单位重量肌肉蛋白含量。抗体稀释: p-Akt (Ser473) 1∶1 000:p-p70S6K(Thr389)1∶1 000。蛋白表达值为条带的灰度值，以内参微管蛋白(tubulin)校正。

1.5RT-qPCR 按照Trizol Reagent液说明书提取总RNA。2 μg RNA逆转录后执行qPCR(ABI7500，美国)，反应使用协同荧光染料(SYBR-Green Master Mix，TaKaRa，中国)，引物根据以往文献设计〔12〕:成肌分化抗原(MyoD):正义链5′-CCTACTACAGTGAGGCGTCCA-3′，反义链5′-GTGGAGATGCGCTCCACTAT-3′(97 bp)；肌形成蛋白(MyoG):正义链5′-AGTGAATGCAACTCCCACA-3′，反义链5′-CGTAAGGGAGTGCAGGTTGT-3′ (129 bp)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH):正义链5′-AGATGGTGAAGGTCGGAGTG-3′,反义链5′-GAAGGTCAATGAAGGGGTCA-3′ (117 bp)。PCR 条件：40循环95℃ 15 s，61℃(MyoD) 或60℃(MyoG)。GAPDH为内参，相对表达量2-△△Ct。

1.6统计学处理 采用SPSS12.0进行双因素方差分析、SNK检验。

2 结 果

2.1肌肉质量和蛋白含量 T组腓肠肌重量及蛋白含量显著高于C组(P<0.05)；T+R组腓肠肌重量及蛋白含量显著高于C组，但显著低于T组(P<0.05)；R组腓肠肌重量及蛋白含量与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各组p-Akt、p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA、MyoD mRNA/MyoG mRNA比较 与C组比较，T组、R组、T+R组p-Akt显著升高(P<0.05)，T组、T+R组p-Akt显著高于R组(P<0.05)；与C组比较，T组、T+R组p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA显著升高,R组显著降低(P<0.05)，T组、T+R组p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA显著高于R组(P<0.05)；T+R组p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA显著低于T组(P<0.05)。与C组比较，T组、R组、T+R组MyoD mRNA/MyoG mRNA显著降低(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组腓肠肌的重量和蛋白含量及Akt、mTOR和生肌因子水平

图1 各组p-Akt、p-p70s6k蛋白表达

3 讨 论

骨骼肌质量的改变(肥大或萎缩)影响着人体或动物的整体运动能力和健康水平，训练(强度依赖性的)诱导肌肉肥大已有报道，而CR的作用则更为复杂——抑制衰老〔14，15〕、氧化应激〔16〕诱发的肌肉萎缩，但对于正常成体肌肉的作用，是引起萎缩〔17〕与否〔8〕，报道并不一致。本研究显示，CR不会降低肌肉量(以体重校正)，但会削弱了运动诱导的肌肉肥大。从生物学意义和发展方向来看，运动的“前景”是“更强”，而CR的前景是“维持”，从需求来看，运动训练是“高能模式”，需要摄取更多热量保持最强状态，而CR进入“省电模式”，减少维持生命之外的一切不必要的能量“开销”，故二者从需求、发展的方向上存在矛盾，这也导致了结果上的折中——联合组肌肉量增长的放缓。考虑到炎症诱发的脂肪填充、水肿会导致肌肉质量虚高，本研究测试了肌肉蛋白含量，结果显示，各处理组蛋白含量均未降低，排除上述误判的可能。

Akt/mTOR通路在蛋白翻译(上调翻译起始和核糖体生物发生)中作用关键〔13〕。Akt在慢性训练后激活〔18～20〕，CR对Akt、mTOR的作用是降低与否存在争议〔1，11〕，可能与CR强度、时间、采样组织有关。本研究提示mTOR依赖性的蛋白翻译对在3种肌肉质量干预中都起重要作用。其中，CR组肌肉量改变与mTOR略有差异的原因可能是CR后分解代谢也在降低，部分抵消了mTOR的作用。Akt活性(p-Akt)的改变和mTOR不一致，在3个处理组均升高。Akt的改变可以解释mTOR活性在运动后的上调，但无法解释该指标在CR后降低及“运动+CR”后升高减缓。这可能与mTOR的另一个重要调控剂AMPK负调控〔21〕有关，CR和运动均能够激活AMPK〔22，23〕，3个处理组中，mTOR的波动反映了AMPK、Akt的博弈，也因此，可能导致这与Akt同步性较弱。

生肌因子MyoD与MyoG在激活肌肉特异性基因转录(前者对应快肌纤维基因、后者对应慢肌纤维基因)中起关键作用，是主要生肌信号的效应器〔24～26〕。二者比值是肌纤维的“快-慢”转化的重要标志〔24～26〕。本研究发现，改变趋势，MyoD mRNA与MyoG mRNA二者均与p-p70s6k(mTOR激活标志)一致，提示，各处理后mTOR依赖性的蛋白翻译的改变至少部分要归因于MyoD 和MyoG 依赖性的基因转录的波动。MyoD/MyoG在各处理组均降低，提示，运动、CR及“运动+CR”均使肌纤维发生“快-慢”的转化。纤维类型转化方向标志肌肉适应的侧重，快肌纤维收缩的力量大、速度快，慢肌纤维有氧代谢能力强、耐力强、更利于自身存活和组织健康〔25，27〕。本研究结果提示，慢性大强度耐力运动的作用是在快慢纤维同时发展基础上，优先发展慢肌纤维，即优先改善耐力和生存，类似情况的是“运动+CR”，差异仅是肌纤维增长均有所减缓，而CR的效果则是在抑制快和慢肌纤维生长基础上，优先保护慢纤维，即放弃力量和速度换取生存和耐力。

综上，慢性CR不会降低肌肉质量(以体重校正)，但会阻碍运动性肌肉肥大。mTOR介导的蛋白翻译在运动、CR和二者联合对肌量的调控中可能有关键作用，且生肌因子MyoD和MyoG 也参与了该调控的介导。CR未降低肌肉质量可能是分解代谢降低部分抵消了合成代谢降低的效果。Akt在干预诱导的mTOR的改变中可能与AMPK负协同。运动、CR和二者联合均让肌肉向“慢”转化，区别是，运动和联合处理均是肌量增长前提下的转化，而CR是肌量基本保持不变下的转化。条件所限，本文仍有一些问题需要在未来解决：第一，因素之间的因果关系推论需要进一步确认(通过阻断、激动等方式)；第二，一些更直接指标有待补充，如ATP的产量及肌纤维类型转化、细胞凋亡与自噬的组织学和形态学指标等；第三，其他类型肌肉反应可能有差异，如比目鱼肌(慢纤维为主)，有待研究。