金花小檗种子总黄酮的优化提取及抗氧化活性

尚志福，郑友琪，张济显，位竹君，张北方，张莹

（东北林业大学化学化工与资源利用学院，黑龙江 哈尔滨150040）

金花小檗（Berberis wilsonae Hemsl.）为小檗科（Berberidaceae）小檗属植物，产于我国云南、四川、贵州、西藏和陕西。金花小檗根枝入药可代黄连用，具有清热、解毒和消炎的功效，用于止痢、赤眼红肿等，也可用为饮料资源[1,2]，小檗属植物三颗针为我国药典收录药材[3]。研究表明，小檗属植物含多种小檗碱类、酚酸类、黄酮类和有机酸类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗惊厥、降血压、改善记忆和抑菌等多种药理作用[4-8]。黄酮类化合物作为重要植物的次生代谢物，具有抗氧化等多种生物活性，在饮料等食品加工领域具有广阔应用前景[9-11]。目前，国内外对小檗属植物的研究主要集中于根茎中的小檗碱类成分，对其他部位的研究相对较少，其中吴莉莉等[12]对产自黑龙江伊春的细叶小檗叶进行了总黄酮测定，65%乙醇提取物的总黄酮含量可达0.513%；李金辉等[13]对采自贵州六盘水的威宁小檗根、茎、叶进行了黄酮类化合物的含量测定和抗氧化活性研究，结果表明威宁小檗叶中的黄酮含量高达126.22 mg/g，且抗氧化活性最好；买尔旦·玉苏甫等[14]对购自新疆维吾尔自治区喀什地区的喀什小檗果实研究表明，喀什小檗果实水提物具有非内皮依赖性的舒张血管作用。金花小檗果实因相关研究开展较少使其应用受到限制。目前，小檗属植物种子的研究多集中于发芽及幼苗更新[15-17]，关于金花小檗种子的化学和药理学研究亦未见报道。本研究以乙醇为提取溶剂，应用超声辅助技术提取金花小檗种子中的总黄酮，在考察功率、体积分数、料液比、温度和超声时间等单因素对总黄酮提取得率影响的基础上，采用响应面（RSM）设计进行提取参数的优化，从而得到最佳提取工艺；再对金花小檗提取物的体外抗氧化活性进行测定，从而为我国小檗属植物的深入开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

金花小檗成熟果实于2020年10月采自西藏自治区林芝市八一镇，室温阴干至恒重后，经手工分离获得金花小檗种子；2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、2,2'-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、2,4,6-三（2-吡啶）-1,3,5-三嗪（TPTZ）、2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）、水溶性维生素E（Trolox）购自美国西格玛奥德里奇公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

JP-100ST超声波清洗机（深圳洁盟清洗设备有限公司）；H1650医用离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；752N紫外-可见分光光度计（上海精科实业有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮提取将干燥的金花小檗种子粉碎并过60目筛备用。取0.1 g金花小檗种子粉末，以不同体积分数乙醇为提取溶剂，采用超声辅助法提取总黄酮，提取结束后经离心（10 000 r/min，10 min），吸取上清液备用。总黄酮得率按式（1）计算：

1.3.2 标准曲线绘制与总黄酮含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝法进行标准曲线绘制与样品中总黄酮的检测[15]。芦丁（RT）标液在0.036~0.360 g/L浓度区间内与吸收值具有良好的线性关系，拟合方程为：y=1.280 6 x+0.083 6（R2＝0.997 7），依据样品液吸收值和拟合方程计算样品液及干样品中的总黄酮。

1.3.3 单因素设计在功率400 W、乙醇体积分数60%、液固比30:1（mL/g）、提取温度（30±2）℃和超声时间20 min等固定条件下，每个因素设6个水平，其中在功率100~600 W、乙醇体积分数0~100%、液固比10:1~60:1（mL/g）、温度30~80℃和超声时间10~60min条件下，考察总黄酮得率对各单因素变化的响应。

1.3.4 响应面设计为得到金花小檗果实总黄酮最佳提取参数，采用Box-Behnken法（Design-Expert 8.0.6版）进行响应面实验优化设计。在单因素试验结果分析基础上，选取对总黄酮得率影响较大的超声功率、乙醇体积分数和液固比等3个因素，以总黄酮得率为响应值，对实验结果进行回归和优化，并对最佳提取参数进行验证。响应面设计见表1。

1.3.5 抗氧化能力评价依据张鹤等[18]的检测方法，评价样品的DPPH自由基清除率，再根据清除率得出样品的IC50值（半数抑制浓度）。依据文献[18]的检测方法，评价样品的Fe3+还原能力，以Trolox当量表示样品FRAP值。依据Xu等[19]检测方法，评价样品的总自由基清除能力（TRAP），以Trolox当量表示样品TRAP值。

1.3.6 数据处理每组试验重复3次，实验结果以均值±标准差表示，用Microsoft Excel 2010、Design-Expert 8.06和Origin 9.0软件进行试验数据分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声功率对提取得率的影响由图1（a）可见，超声功率100~500 W时总黄酮得率呈现上升趋势，超声功率500~600 W时总黄酮得率略有下降。原因可能是一定条件下超声波的空化效应会加速黄酮类成分的释放，总黄酮得率在500 W时最大，继续增加功率，可能造成黄酮成分破坏，使总黄酮得率略有下降。

2.1.2 乙醇体积分数对提取得率的影响如图1（b）所示，乙醇体积分数在0~60%时总黄酮得率与乙醇体积分数变化趋势相同，乙醇体积分数60%时总黄酮得率达到峰值，继续提高乙醇体积分数，总黄酮得率逐渐迅速降低，乙醇体积分数为100%时总黄酮得率仅为13.17 mg RT/g。原因可能是金花小檗种子的主要黄酮类成分极性接近60%乙醇，乙醇进一步提高，过多醇溶性和脂溶性杂质溶出，使得总黄酮得率下降[20]。

2.1.3 液固比对提取得率的影响由图1（c）可见，液固比为10:1~30:1时总黄酮得率随液固比增大而迅速提高，在液固比为30:1时总黄酮得率达到峰值，液固比进一步增大时总黄酮得率变化较小。原因可能是液固比适量增大使料液接触更充分，促进黄酮类化合物溶出；当溶剂满足溶质溶解需要后，继续增加溶剂量可能导致其他杂质也被大量提取出来，且溶剂过多易导致后续浓缩等工艺中的总黄酮损失，导致目标成分得率下降[21,22]。

2.1.4 提取温度对提取得率的影响如图1（d）所示，总黄酮得率在提取温度为30~60℃时快速增加，60~70℃时增速变缓并在70℃时达到峰值，进一步升高温度时总黄酮得率略有下降。原因可能是黄酮类成分在乙醇溶液中的溶解度随温度升高而增大，但温度过高又会破坏黄酮类化合物结构稳定[23]，从而导致黄酮提取率下降。

2.1.5 超声时间对提取得率的影响由图1（e）可见，超声处理时间在10~40 min时，总黄酮得率随超声时间延长而迅速提高，超声40 min后总黄酮得率随时间延长呈小幅下降趋势。原因可能是超声时间过长会导致溶剂挥发增多，以及黄酮类成分氧化或分解[22]，从而使总黄酮得率在提取溶液体系达到传质平衡后开始逐渐下降。

图1 提取条件对总黄酮得率的影响Fig.1 The effects of different conditions on the yields of the total flavonoid

2.2 总黄酮提取参数的RSM优化

2.2.1 RSM实验设计与结果由单因素实验结果，选取超声功率（x1）、乙醇体积分数（x2）和液固比（x3）为响应变量，以金花小檗种子总黄酮得率为响应值（y），应用Box-Behnken法，进行3因素3水平的提取参数响应面优化，见表1。

表1 Box-Behnken实验设计与结果Table 1 The Box-Behnken design and results

对表1的实验结果进行回归分析（表2），得到以金花小檗种子总黄酮得率y为因变量，以x1、x2、x3为自变量的回归模型方程式（2）：

表2 方差分析Table 2 The analysis of variance

由表2的方差分析结果可知模型的F值=65.98（P＜0.000 1），达到极显著水平，具有统计学意义；失拟项的P=0.190 5，不显著，即模型的拟合度好；复相关系数（R2）为0.988 3，校正决定系数R2Adj为0.973 4，说明预测值与实测值高度相关，可解释97.34%的总黄酮得率响应值变化。因此，所建模型的准确性和可信度较高，可用于提取分析和预测总黄酮提取得率。

2.2.2 RSM结果分析由图2 a可见，液固比为30:1时，等高线图接近圆形，说明超声功率（x1）和乙醇体积分数（x2）的交互作用对得率的影响均不显著[24]。由图2 b可见，乙醇体积分数为60%时，总黄酮得率随功率提高而增加，在液固比加大情况下，总黄酮得率先降后升，且等高线为椭圆形，表明功率和乙醇体积分数之间具有交互作用。从图2 c可知，超声功率为500 W时，随着乙醇体积分数和液固比提高，总黄酮得率均呈先增后降趋势，等高线为近圆形，说明乙醇体积分数和液固比的交互作用对总黄酮得率影响不显著。

图2 不同提取变量相互作用对总黄酮得率影响的响应面图Fig.2 Response surface plots for interactions between three extraction parameters on extraction yields of the total flavonoids

2.2.3 最佳工艺条件与验证将实验结果带入软件，分析得到最佳工艺条件：功率503W，乙醇体积分数59%，液固比31:1，预测总黄酮得率最大值21.27 mg RT/g。考虑到实验操作的便捷性，对预测得到的最佳工艺进行小幅调整：功率500 W，乙醇体积分数59%，液固比30:1，提取温度70℃，超声时间40 min，在此条件下平行进行3次实验，测得TF的得率为（21.36±0.26）mgRT/g，与预测值误差小于1%，说明实验结果与模型关联度较好，模型的预测结果可信度高。

2.3 抗氧化活性

最佳工艺下得到的提取物分别检测其DPPH自由基清除率、FRAP值和TRAP值（图3）。由图3 a可见，金花小檗提取物对DPPH自由基的清除率随其质量浓度的增大而逐渐提高，提取物质量浓度为111mg/L时的自由基清除率可达54.65%，提取物对DPPH的IC50值为89.46 mg/L，Vc对DPPH的IC50值为3.45 mg/L。由图3 b可见，金花小檗提取物质量浓度与FRAP值和TRAP值之间也呈现出明显的正相关关系；提取物质量浓度为111mg/L时，FRAP值为19.69molTrolox/L，TRAP值为30.93 mol Trolox/L。

图3 金花小檗种子提取物的抗氧化活性评价Fig.3 The antioxidant properties of the B.wilsonae seed extracts

3 讨论

目前，国内外对金花小檗种子总黄酮的研究相对较少，对其优化提取以及抗氧化方面的研究亦尚属空白。该试验采用超声辅助乙醇提取金花小檗种子总黄酮，通过单因素试验和响应面设计获得优化提取参数，得到最佳提取参数为超声功率500 W、乙醇体积分数59%、液固比30:1（mL：g）、提取温度70℃、超声时间40 min，该条件下金花小檗种子总黄酮提取得率为21.36 mg RT/g；进一步利用3种不同体外实验方法检测提取物的抗氧化活性，金花小檗种子质量浓度为111 mg/L时DPPH自由基的清除率可达54.65%，FRAP值和TRAP值以每克样品的Trolox当量表示，分别为19.69 mol Trolox/L和30.93 mol Trolox/L，为综合开发利用我国小檗属植物资源提供了理论依据。