手性差异对水产养殖沉积物环境中农药氰戊菊酯降解的影响

宋 超，邹剑敏，汪 倩，陈 曦，方龙香，裘丽萍，陈家长

（1中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡214081；2农业农村部水产品质量安全环境因子风险评估实验室（无锡），江苏无锡214081；3农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京100000）

0 引言

底泥是水产养殖环境不可忽略的一部分，既是水体营养的沉积地，也是环境污染物的蓄积场所[1]。底泥生态环境中的物质循环不仅影响着底栖生物的生存，也关系着整个水体的物质和能量平衡。随着工业的发展，有机污染物在水生态底泥环境中的不断富集，必然会威胁整个养殖环境。近年来，拟除虫菊酯不断被应用于农业和卫生安全等领域[2]，氰戊菊酯(fenvalerate，FV)作为常用的拟除虫菊酯类农药，自然成了底泥污染物中常见的一类，其在水产养殖底泥环境中也开始被频繁检出[3-4]。徐春娟[5]在四川的一些养殖水体中发现FV残留的存在，Wang等[6]在沉积物中发现了FV的普遍存在。FV在环境中的生态毒性已经被学者们广泛研究，其对养殖产品和其他水体生物存在较高的毒性作用[7-9]。然而，FV在底泥环境中到底存在着怎样的降解规律，并没有研究进行探究。FV在底泥中的降解转化将直接决定水体生物的安全，在养殖环境中，甚至会间接影响养殖产品的质量安全。陈莉等[10]研究了FV在不同土壤环境中的降解趋势，并发现其在土壤中的半衰期长达17.7～25.3天之久。底泥作为类似的复杂环境，FV的降解趋势需要进行进一步探究。

另外，FV的4种手性异构体在环境中的生态毒性具有较大的差异[11]，其在底泥环境中的降解差异并没有学者进行详细阐述。为探究FV及其不同异构体在养殖底泥环境中的降解消除规律，本研究以池塘底泥为试验对象，观察不同添加浓度和不同异构体的FV在底泥中的降解情况，以期为养殖池塘底泥中FV残留的去除及环境监测工作提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用FV标准品（4种手性异构体混合物，纯度>95%）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，FV乳油（纯度95%）购自湖北安博共创科技有限公司。FV的4种手性异构体分别为αR-2S-FV(FV1)、αS-2R-FV(FV2)、αR-2R-FV(FV3)和αS-2S-FV(FV4)，其中FV1和FV2为反式异构体，FV3和FV4为顺式异构体，这4种异构体均由95%FV乳油分离纯化得到[12]。所用丙酮和正己烷为色谱纯溶剂，均购买于德国默克试剂生物科技公司。标准品溶于丙酮，在-20℃的条件下储存备用。

底泥样品材料于2018年5月23日采自扬州江都市吴堡县罗氏沼虾养殖塘（取表层1～10 cm底泥）[13]。采样池塘的主要水质指标和底泥相关指标详见表1和表2。试验开始前对底泥样品中拟除虫菊酯类农药残留情况进行排查，采用1.3的检测方法，确保所选底泥样品没有常规的拟除虫菊酯类农药残留。

表1 采样池塘底泥的理化指标

表2 采样池塘水的理化指标

1.2 试验设计

配制浓度分别为10、100 mg/L的FV、αS-2S-FV、αR-2S-FV、α-2R-FV和αR-2R-FV 5种储备溶液，溶于丙酮。取经过灭菌的500 mL三角瓶30个，分为10组，每组设置3个平行。第1～5组为低浓度组，6～10组为高浓度组，每组中均加入330 g底泥，具体试验分组设计如表3。

表3 试验设计分组方案

三角瓶用纱布封口，在生化培养箱中于25℃、黑暗条件下静置培养。预培养1天后，在三角瓶中加入相应药品，配制成浓度为20 μg/L和200 μg/L的底泥样品。低浓度设定值参考赵晨等[14]在底泥环境中的检测结果（平均浓度21.8 μg/L），高浓度值依据环境检出浓度的10倍设定。培养过程中定期补充蒸馏水（补水量=前次采样后样品瓶总重-当次采样前样品总重）。分别在加药培养的第0、7、14、21、28天采取15 g左右底泥于50 mL离心管中，用于监测样品瓶中添加FV及其异构体的浓度变化和异构体转化情况。试验所用FV（混标）的4种手性异构体占比情况根据张敬卫等[15]手性异构体的分离方法测定。

1.3 氰戊菊酯检测

1.3.1 样品前处理 称取5 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入2 g铜粉后震荡0.5 min，再加入20 mL正己烷/丙酮(1:1，V/V)混合液。在2000 r/min条件下震荡涡旋5 min，超声10 min。将样品放入冷冻离心机中，在8000 r/min条件下离心5 min。离心结束后，转移上层有机相至氮吹管中，并在40℃水浴条件下用氮气吹干。用1 mL正己烷/丙酮(6:1，V/V)混合液复溶，使浓缩液通过已活化的GCB+Florisil固相萃取柱（用10 mL正己烷活化），再用6 mL正己烷/丙酮(6:1，V/V)混合溶液分3次润洗氮吹管，并作为洗脱液洗脱萃取柱。用氮吹管收集滤过液及洗脱液，在40℃水浴条件下用氮气吹干，用1 mL正己烷定容。经0.22 μm的有机相滤器过滤，转移至进样瓶中，待上机测定。

1.3.2 样品检测 Agilent-7890A气相色谱仪；色谱柱：DB-5毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；检测条件：载气为高纯氮气；线速度30 cm/s；进样方式我脉冲不分流，脉冲压力40 psi，截止时间0.5 min；进样口温度 260℃；进样量 1 μL；ECD 检测器；检测器温度310℃；尾气为氮气；尾吹30 mL/min；升温程序：100℃，保持1 min，以30℃/min升至250℃，再以20℃/min，升至290℃，保持8 min。

1.3.3 样品定量 在10～500 μg/L范围内配制梯度标准溶液。采用外标法色谱结果进行定量计算，在对不同色谱峰对应的响应面积分别进行定量计算不同异构体浓度。以10倍信噪比作为定量限，该方法定量限为1 μg/L，加标回收率范围在80.70%～94.65%，平均值为87.17%。

1.4 数据分析

根据气相色谱定量得出水中药物浓度后，通过一级反应动力学方程进行拟合，方程如(1)所示[16]。

其中，Ct表示药物在时间t的浓度，C0为药物初始浓度，t为持续时间，k为消除速率常数，并通过式(2)计算半衰期。

所有数据利用Excel进行处理，样本间FV降解半衰期差异通过SPSS 19.0软件进行ANOVA分析(P<0.05)，在95%置信水平下(α=0.05)进行差异检验。小写和大写字母分别表示高和低浓度组FV及其手性异构体间的多重比较结果，如果两组间有相同字母，则表示不显著，反之显著。

2 结果与分析

利用液相手性分离方法，发现试验所用FV中的4种手性异构体FV1、FV2、FV3和FV4的所占比例分别为25.13%、28.27%、21.92%和24.69%。顺式对映体部分所占比例低于反式对映体比例（表4）。

表4 氰戊菊酯在液相色谱中的手性分离结果

当转化进行3周后，转化速率变慢，转化产物变化开始不断减少。对FV的浓度数据进行拟合，得到的各个方程均有较高的相关性系数（表5）。拟合结果表明，FV的降解过程符合一级降解动力学，初始浓度并不影响FV的降解趋势。FV及其手性异构体在底泥环境中的半衰期如图1所示。高浓度组，FV、FV1、FV2、FV3、FV4的半衰期分别为(26.77±1.67)、(36.15±3.34)、(19.45±0.50)、(31.05±0.65)、(23.19±2.80)天。低浓度组，FV、FV1、FV2、FV3、FV4的半衰期分别为(28.97±1.63)、(38.73±2.88)、(19.47±0.91)、(32.05±1.35)、(24.51±1.06)天。高、低浓度组间FV及其手性异构体的半衰期没有显著差别，表现基本一致，从大到小依次是FV1＞FV3＞FV＞FV4＞FV2。根据统计性检验分析，高、低浓度组，FV1的降解半衰期显著高于其他异构体，FV3显著高于FV2和FV4。

图1 底泥样本中氰戊菊酯及其手性异构体的半衰期

表5 氰戊菊酯的降解动力学方程

FV存在4种不同的手性异构体，但在气相色谱仪器中常以顺式和反式对映体2种形式出峰。不同手性异构体在环境中的转化形式如图2所示[17-18]，FV2与FV3之间会发生互相转化，FV1与FV4之间会发生互相转化，均在α-C位置发生异构。所以当单个手性异构体在环境中进行异构体转化时，在色谱峰图上其相对应的对映体峰位置会有新的峰出现。本研究结果发现高浓度组和低浓度组均存在不同程度的异构体转化，图3和图4中每条曲线为该FV手性异构体对应的在α-C位置异构的手性异构体的干重浓度变化。低浓度和高浓度处理组中的4种手性异构体呈现一致的转化趋势，在培养的第1周之后手性异构体的转化速率开始加快，第3周达到转化的峰值，之后转化速率便开始显著下降。

图2 氰戊菊酯气相色谱图及其异构体转化规律

图3 低浓度组氰戊菊酯各手性异构体的转换情况

图4 高浓度组氰戊菊酯各手性异构体的转化情况

3 结论

研究发现，FV在底泥环境中的降解过程符合一级降解动力学方程。不同暴露浓度条件下，FV及其手性异构体的降解半衰期无显著性差异。FV在底泥环境中有较长的降解周期，其降解半衰期范围是19.47～38.73天。FV的不同手性异构体在底泥环境中的降解半衰期存在一定差异，在渔业环境监测时需要分开进行。FV在底泥环境中存在α-C位置异构现象，当转化进行一定时间后，转化产物开始不断减少。

4 讨论

本研究利用FV的液相手性分离方法发现FV中的4种手性异构体的含量所占比例较为相近，按大小顺序依次是FV2＞FV1＞FV4＞FV3。整体来看，顺式对映体部分所占比例低于反式对映体比例。FV的降解过程为一级反应，即FV在底泥环境中有着固定的降解趋势，但高浓度FV的降解速率会显著高于低浓度FV。其原因或许与底泥中微生物群落的反馈作用有关，高浓度FV对微生物群落造成了较显著的影响，使得环境中产生可利用FV的优势种群。Birolli等[19]曾在土壤中分离得到可以加速FV在土壤中降解的菌株。本课题在水体FV降解规律的研究中同样发现微生物对FV降解所起到的重要作用。

根据FV中手性异构体组成比例的不同和其不同手性异构体在底泥环境中的降解半衰期结果，可以计算得出FV在底泥环境的降解半衰期范围在19.47～38.73天之间。相比于Zhang等[20]在水环境中的研究结果（FV降解半衰期范围在4.75～11.95天），本研究中FV在底泥中的降解速率较为缓慢。本研究试验条件为25℃，高于一般底泥环境的温度，可见FV在实际较低温度环境中会更难以降解。Cotham等[21]发现在pH 7.3～7.7的海水/沉积物系统中，FV半衰期为12天，且存在由海水向沉积物中转化的情况。有研究发现，pH增大会提高FV在沉积物中的溶解度[22]。因此，FV在进入水产养殖环境后更易在底泥中长时间蓄积，且对底泥环境存在较大的威胁。所以，在对水产养殖池塘清塘时应尽量避免使用FV清除野杂鱼和甲壳类水生生物，以免造成FV的残留。

另一方面，FV不同异构体在底泥环境中的降解差异需要引起重视。不同异构体间，FV2在底泥环境中降解最快，其次是FV4、FV3和FV1。Corcellas等[23]发现，拟除虫菊酯的环境残留中顺式异构体比例比反式异构体更高。赵晨等[14]发现太湖和巢湖的底泥沉积物中存在较高浓度的高效FV残留。本研究并没有发现顺式对映体和反式对映体在半衰期上的显著性差异，环境中顺式对映体富集较高与高效氰戊菊酯的大量使用存在一定的关系[11]。由于顺式异构体在环境中有较高的生态毒性[24]，顺式FV在环境中的生态危害大于反式FV。目前对于FV的生态监测多是检测FV的残留，所以对FV不同异构体分开进行监测和风险评估尤为重要。

不同异构体除了在降解上的差异之外，还会存在不同手性异构体之间的转化。本研究结果与Liu等[17]的研究一致，FV同样在α-C位置发生异构，进行顺式和反式异构体之间的相互转化。Li等[12]发现，αS,2SFV在向αR,2S-FV转化时，当αR,2S-FV增加到一定浓度时便开始减少。本研究4种异构体均有着相同的趋势，当FV在第3周转化到最高值时也开始减少。这一结果说明FV不同异构体在降解的同时存在着手性异构的相互转化，当转化到一定程度时，转化速率开始减慢，转化产物同样开始降解。随着FV暴露时间的增长，FV在环境中主要存在的消除行为是化学降解，而不再进行手性异构体之间的相互转化。一些学者发现，手性菊酯类农药在极性溶剂和碱性条件下易存在α-C位置的手性异构[25-27]。所以，在进行环境监测时，FV样品应在酸性条件下保存非极性溶剂中，确保结果的稳定性。在顺式对映体残留较高的环境中，可以通过提高环境pH的方式促进顺式对映体的转化，以降低FV的生态毒性。李邵彤[28]发现拟除虫菊酯类农药不同异构体的降解快慢不仅源于环境理化因素，还与微生物的活动密不可分。所以在促进高毒性和残留浓度较高的异构体转化时，可以考虑微生物的作用。