百香果茎基腐病菌分离鉴定与药剂筛选研究

邝瑞彬，杨 护，杨 敏，周陈平，黄炳雄，魏岳荣

（广东省农业科学院果树研究所/农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广州510640）

0 引言

百香果属于西番莲科西番莲属的多年生常绿攀缘木质藤本植物，原产于巴西、巴拉圭至阿根廷等南美洲国家，果汁酸甜，营养丰富，风味独特，集食用、观赏及药用价值于一身，具有十分广阔的市场前景[1-4]。中国百香果自20世纪80年代初开始人工引种栽培以来不断引种驯化和杂交选育，2019年初在广东、福建、广西、云南等各栽培区迅猛发展近3.3万hm2，产量约达100万t[5-6]。但是，近年来百香果茎基腐病发生严重，已成为百香果产业发展的主要限制因素，南方产区春夏雨季（5—8月）尤其多发，病重果园植株发病率达30%～40%，死亡率高达40%～60%。国内百香果果园大部分以价廉的带土杯装扦插苗为主，存在带病土传播的风险，使茎基腐病逐步蔓延传播至广东、广西、福建等百香果主产区，造成严重经济损失[6-7]。百香果茎基腐病报道始于20世纪80年代末，病症多发生在植株距离地面5～15 cm的茎基部，幼苗阶段百香果感染后，茎基部会出现深褐色斑状，茎基皮层会逐步变软进而腐烂、产生褐腐，其叶片发生萎蔫、黄化及脱落的情况，慢慢枝蔓枯萎乃至植株枯死[8-10]。早在20世纪90年代，李德富等[11]和郑加协等[12]从百香果病株分离鉴定其病原菌为土传真菌腐皮镰刀菌(Fusarium sloani)和尖镰孢(Fusarium oxyporum)，两者都是根据传统菌株形态观察鉴定。菌株形态观察鉴定的方法存在一定的主观性。近年来的百香果相关研究主要集中在其茎基腐病的田间病症、防治栽培及技术研究方面[13-14]；国外学者在巴西、南印度等地亦陆续分离并鉴定了侵染百香果的镰刀菌，与国内研究结果较为一致，但对病菌致病性检测和防治等缺乏后续报道[15-16]。采用传统形态学与分子生物学技术[7,17-18]，在病原菌侵染早期进行准确、快速科学鉴定百香果茎基腐病致病真菌，开展病菌致病性研究，采取针对性的防控措施，可有效防止病情蔓延，减少生产损失。

本研究在广东省百香果主产区采集茎基腐病病株，结合形态学观察与分子测序方法鉴定分离病原菌菌株，并对菌株进行致病性检测，同时检测系列化学杀菌剂对病菌生长、形态及其致病性的影响，以期为后续百香果茎基腐病菌致病机理、百香果抗病育种等研究提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 百香果茎基腐病病原菌分离与培养

根据百香果茎基腐病典型病症，在广东省广州、云浮、肇庆、茂名、河源等百香果产区田间采集百香果茎基腐病感染植株10个。参考Bueno等[16]的病原菌分离方法，各病样取约6 cm病健交接处部位，在超净工作台依次用70%酒精和0.5%次氯酸钠消毒，无菌水清洗。切取病部置于无菌马铃薯固体培养基(PDA)上，28℃培养箱暗培养5～8天。经2～3次培养，纯化后最终获得了8个病原菌真菌菌株，置于4℃下储藏备用。

1.2 病原菌形态观察与分子检测

经单胞纯化的病原菌菌株，分别置于马铃薯固体培养基(PDA)和康乃馨叶汁固体培养液(CLA)各自暗培养6天，记录菌落颜色、形态及生长情况，用光学显微镜观察病原菌的菌丝、分生孢子及厚垣孢子等形态，初步鉴定百香果茎基腐病病原菌的种[19-20]。在形态学特征鉴定的基础上对分离菌株进行分子测序鉴定。接种待测菌株马铃薯液体培养基(PD)震荡培养3～5天，采用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen，北京）提取病原菌的DNA。利用对分离菌株的核糖体基因内转录间隔区域（rDNA-ITS区域）和镰刀菌特异性引物翻译延长因子1α基因（EF-1α序列）进行PCR扩增，产物回收纯化及测序。将获得的rDNA-ITS区域和EF-1α序列与GENBANK数据库(NCBI BlastN)进行相应序列的同源性比较分析，并选取数据库中已知种名的近源镰刀菌序列，利用DNAMAN和MEGA6.0软件用邻接法构建系统发育进化 树 。ITS1(5’-3’)：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；EF-1αF(5’-3’)：CGCCTTGCTATTCCACAT，EF-1αR：CAACATACCA ATGACGGTGA。PCR反应体系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，进行35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR引物合成及PCR产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 病原菌致病性检测

按照柯赫氏法则进行病原菌的致病性测定。在离体致病性检测实验中，以‘台农1号’、‘黄金果’2个主栽且易感病品种的百香果为材料，选取苗期植株匀称的枝条，每个处理取枝条3支，每支剪取约6 cm茎段6个，用70%酒精进行表面消毒，放置于无菌培养皿中，干净刀片轻刮表皮，放置均匀菌块在伤口处进行接种[7]。不接种为对照，8个病原菌株系(FP1～FP8)，共9个处理，每个处理设3个重复，每个重复6个茎段。将样品置于恒温培养箱，28℃暗培养，每天观察记录，共观察6天。根据茎秆感染程度划分病情等级为5级。0级，茎秆无明显侵染；1级，茎秆伤口处开始发生少量褐化；2级，伤口处褐化加重，向伤口两侧渗透约1 cm；3级，伤口处褐化面积扩大约1.5 cm，可见明显白色菌丝生长；4级，伤口处褐化面积扩大约2 cm，白色菌丝生长较旺盛；5级，伤口处变褐溃烂，褐化面积扩大约3 cm，白色菌丝生长旺盛。在活体检测分离菌株致病性实验中，参考Silva等[21]的方法，培育健康粗壮的百香果扦插苗为植物材料，配制PD培养液，培养菌液3～4天，将孢子浓度调整至106孢子/mL；对百香果扦插苗采用伤口接种法进行接种，清水为对照，3个重复，每个重复为10株。接种后常规管理，20～40天后观察植株病情，根据果苗病症记录发病情况，计算发病率，如式(1)。切取果苗发病株的感病茎基部组织，同上述分离纯化，采用形态观察法和分子鉴定进行再次确认。

1.4 不同杀菌剂对病原菌生长、形态和致病性的影响

选取常规杀菌剂8种（99%恶霉灵、45%咪鲜胺、80%烯酰吗啉、33%春雷王铜、30%苯甲嘧菌酯、60%霜脲嘧菌酯、12%甲密甲霜灵、24%噻呋酰胺），无菌水配制好母液，按照实验设计稀释成设定目标浓度10倍的药剂浓度备用，用0.45 μm过滤后，按比例加入约40℃PDA混匀制成测试平板。直径8 mm均匀菌块(strain FP6)接种到每个平板中央放置，28℃暗培养8天，每2天记录生长情况。以常规PDA为对照，共9个处理，每个处理3个重复，采用十字交叉法测量菌落直径，并计算抑菌率[21]，如式(2)。在离体实验中，选取成熟匀称的百香果枝条，剪取约6 cm茎段，70%酒精进行表面消毒，放置于无菌培养皿中，无菌刀片轻刮表皮，再用设定浓度的杀菌剂喷洒表面，风干后放置均匀菌块在伤口处进行接种。不接种和无菌水处理为对照，共10个处理，每个处理设3个重复，每个重复6个茎段。将样品置于植物恒温培养箱(28℃)，每2天观察记录，共观察6天，记录处理茎段的病菌侵染情况（同1.3）。

1.5 数据处理

采用Excel 2007软件对实验数据进行处理，SPSS 19.0软件对实验数据进行显著性分析，采用Duncan新复极差法分析显著性水平，P＜0.05差异显著。

2 结果与分析

2.1 百香果茎基腐病病原菌分离及鉴定

2.1.1 百香果茎基腐病田间症状 百香果茎基腐病多发生在高温多雨季节的阴蔽果园，主要从根、茎基部伤口入侵，病症多发生于距离地面5～15 cm的茎基部位置。受感染的百香果茎基部初期会出现斑块状褐色或深褐色部分，逐步地其茎基表皮层就会变软，产生褐腐，阴湿病园病株茎基部常见灰白色菌物，并产生腐烂霉臭味道，病株茎部表面横切面木质部可见褐黄至褐色病斑；其上部叶片逐步发生萎蔫、黄化及脱落的情况，幼果发生萎缩和落果的现象，枝蔓逐渐枯萎乃至植株枯亡（图1）。

图1 百香果茎基腐病感染病症

2.1.2 百香果茎基腐病原菌形态特征 在广东省百香果主产区采集染病样品10个，利用PDA培养基进行分离培养，纯化获得8个真菌菌株，并利用光学显微镜观察形态特征。结果显示，在PDA培养基多产孢子，CLA培养基则可观察到分离菌的不同生长形态，如菌丝、分生孢子及厚垣孢子等。在PDA培养基中，不同的菌株样品中，镰刀菌形态略有差异（表1）。一般来说，分离菌落为气生菌丝薄绒状，呈白色、米白色或浅粉红色，大型分生孢子为镰刀型，一般为2～4个隔，大小为(45.3～185.2)μm×(12.1～18.5)μm，小孢子多为椭圆或长卵形，大小为(25.5～65.7)μm×(7.2～11.5)μm。各分离菌株呈典型的镰刀菌真菌分生孢子，初步判断为镰刀菌真菌引起的病害（图2）。

图2 百香果茎基腐病原菌形态特征

表1 百香果茎基腐病原菌菌株形态

2.1.3 百香果茎基腐病原菌株分子鉴定 利用通用引物ITS1/ITS4可扩增获得长度为537～567 bp的片段。将测序所得序列进行BLAST在线比对分析，发现其中分离获得的8个菌株(FP1～FP8)的rDNA ITS序列与NCBI数据库中多个腐皮镰刀菌菌株对应序列(Fusarium solani)（登录号 MK734064.1、KY978584.1、MK734064.1、MH160786.1、MF782768.1等）的相似性高达100%（图3）。根据镰刀菌特异性引物翻译延长因子1α基因（EF-1α序列）进行PCR扩增，将测序所得序列进行对比分析，基于EF-1α序列相似性构建的系统发育进化树，结果显示，百香果茎基腐病菌菌株FP1～FP8与腐皮镰刀菌(F.solani)的多个分离物聚为一个分支，以上菌株与尖孢镰刀菌(F.oxyporum)菌株、禾谷镰孢菌(F.graminearum)菌株及轮状镰刀菌(F.verticillioids)分属不同镰刀菌分支（图4）。通过形态特征观察、分子生物学鉴定，分离获得的百香果茎基腐病菌鉴定为腐皮镰刀菌(F.solani)。

图3 百香果茎基腐病原菌菌株基于ITS和EF-1a的PCR分子检测

图4 百香果茎基腐病原菌菌株基于EF-1a序列相似性构建的镰刀菌系统发育进化树

2.2 百香果茎基腐病原菌致病性检测

百香果致病性检测实验采用离体及活体检测2个方法。菌株离体接种致病性测定结果显示，2个易感病品种（‘台农1号’(TN)，‘黄金果’(HJG)）接种1～2天后，接种部位开始出现浅褐色病斑；第3天后，病斑沿茎段呈条形扩展，呈褐色水渍状；第4天起，部分茎段枝条水渍腐烂，白色菌丝明显（图5）。根据茎秆受菌株感染程度划分为5级，第6天统计结果显示，不同菌株在2个感病品种致病力反应基本一致，在‘黄金果’中比‘台农1号’致病力更高。不同菌株致病性能力有差异，其中FP2、FP3、FP6和FP7的致病力较高。活体接种致病性测试结果显示，接种2周后接种部位开始出现浅褐色或褐色病斑；接种30天后病斑逐步变大，茎基部变褐，植株叶片开始皱缩萎蔫；接种40天后，病株叶片凋落，部分植株枯黄甚至死亡（图6）。菌株致病力在‘黄金果’中发病率高达50%以上，在‘台农1号’略低，发病率为10%～60%不等。FP6在‘台农1号’中发病率为最高为60%，在‘黄金果’中达90%，所以其致病力为最高。病菌致病力测试中，离体和活体实验结果较为一致，综合两者，筛选出致病力较高的菌株为FP6、FP7、FP2，其次为 FP1、FP3、FP8和 FP4，最低为FP5。以上植株发病后从病斑上再次分离，获得与接种病原菌相同的分离菌株。

图5 百香果茎基腐病原菌菌株致病性测试（离体实验）

图6 百香果茎基腐病原菌菌株致病性测试（活体实验）

2.3 不同杀菌剂对病菌生长形态及其致病性的影响

为探究防治百香果茎基腐病菌，以8种常规杀菌药剂为材料（表2），研究其对病菌(FP6)的生长及形态等影响，并在离体实验中观察不同药剂处理对接种病菌的抑制效果。结果显示，T2对病菌生长抑制力显著高于其他药剂处理(95.56%)，其次为T5、T6和T7，抑制率最低为T1和T8（表2）。在离体实验中，百香果茎段经杀菌剂处理后，在伤口处进行接种。结果显示，不同药剂处理后，T5处理后的病情等级最低，其抑制效果最佳，T2、T6、T7略逊色；T8、T4在早期有抑菌作用，但后期抑菌力较差；T1、T3抑菌效果最差。离体检测与处理菌株生长形态的结果基本相符。建议栽培中避免长期、单一使用内吸性杀菌剂，优先选用杀菌剂苯甲嘧菌酯，适当利用咪鲜胺、春雷王铜、霜脲嘧菌酯、甲密甲霜灵等混用或轮用，可有效治理百香果茎基腐病害。

表2 不同药剂对菌株生长及致病力的影响

3 结论与讨论

3.1 百香果茎基腐病菌鉴定与致病性

引起植物枯萎病（黄萎病、茎腐病等）的土传真菌镰刀菌属大约由70个种组成，其中主要包括茄腐皮镰刀菌(F.solani)、尖镰孢菌(F.oxyporum)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、轮状镰刀菌(F.verticillioides)等，主要的致病真菌毒素包括镰刀菌酸、白僵菌素、毛霉烯、伏马菌素等；其主要危害包括植物致病性造成产量损失，产生真菌毒素污染及对人类和牲畜的健康造成影响[22-24]。百香果茎基腐病属土壤镰刀菌真菌引起的病害，在南美巴西、非洲、澳大利亚及韩国等东南亚国家与中国主产区如广东、广西、福建及海南等地均有报道，发病时间集中多在春夏多雨季节，传播速度快，防治困难，导致果园产量骤减，经济效益严重受损[6-7,13,15]。李德富等和郑加协等[11-12]根据传统菌株形态观察鉴定其病原菌为腐皮镰刀菌(F.sloani)、尖孢镰刀菌(F.oxyporum)；近年发展的分子测序手段在镰孢霉属真菌等真菌生物鉴定应用上，大大提高了鉴定的准确性和科学效率[18,24]。宋晓兵等[7]利用病原菌形态特征观察和分子生物学鉴定测定，确定广东西番莲茎基腐病原菌为腐皮镰孢菌(F.solani)，但是只有一个样本数量，尚欠缺代表性。本研究在广东省百香果主产区田间采集茎基腐病病株样品10个，成功分离纯化获得8个真菌菌株，经形态学观察法与分子鉴定方法对菌株鉴定，确定分离获得的百香果茎基腐病菌鉴定为腐皮镰孢菌(F.solani)，与前人研究较为一致，与宋晓兵等结果相比更具代表性[7,11-12]。经离体与活体实验，对不同菌株进行了致病力测试，筛选了致病性较强的3个菌株，为进一步研究茎基腐病致病机理、防治措施和抗性育种等提供了材料基础。本研究较为科学、全面地了解广东省百香果产区茎基腐病的致病菌情况，为进行百香果茎基腐病原菌早期鉴定及致病机理研究，开展针对性防控措施及抗性育种等研究提供材料和技术基础。

3.2 百香果茎基腐病的防治

百香果茎基腐病是百香果产业发展的重大威胁，多雨季节常见于扦插苗幼苗期或2年期老苗植株，其传染性强，主要通过流通带土病苗、雨水、农田灌溉、农耕工具、昆虫咬食等途径传播，严重时田园植株枯黄死亡，颗粒无收。镰刀菌真菌病害防治实践中目前依赖于化学杀菌剂，如70%甲基托布津涂抹法、50%多菌灵可湿性粉剂、60%代森锌等均有一定效果[13,26]。在本实验中，选取了8个杀菌药剂，研究不同药剂处理对菌株生长及致病力的影响，实验结果显示，30%苯甲嘧菌酯（1500倍）的抑制效果为最佳，其次为咪鲜胺、霜脲嘧菌酯、春雷王铜、甲密甲霜灵。初步田间实验结果显示，避免单一药剂施用，采用几种药剂混用或轮用，可有效治理百香果茎基腐病害。本实验结果是前人报道的有效补充，可为后续茎基腐病综合防治提供理论基础。

为了百香果产业的可持续发展，建议百香果茎基腐病防治采用综合防控手段。（1）防治应以预防为主，种植前选择适宜低缓坡地，对土壤施用适量石灰或石硫合剂进行消毒，中和土壤酸度；增施腐熟有机肥和生物肥为底肥，增加有益菌群[27]。（2）建议选择抗性砧木的健康嫁接苗，并减少带土扦插苗传播病害的风险。（3）适当选择通风透光的搭架修剪模式，果园间作、轮作栽培。（4）及时疏通积水，建议地下水为水源的水肥灌溉措施。（5）均衡施肥，避免施用过量氮肥，花期及结果期适量补充钾元素，提高抗逆性。（6）做好病源早期检测与预防工作，利用70%甲基托布津、咪鲜胺、春雷王铜、苯甲嘧菌酯、霜脲嘧菌酯等化学药剂进行早期防治，严重病株要及时销毁并清理出园，并做好消毒工作。（7）开展抗病育种研究，利用传统与分子育种手段创制抗病新种质，改变百香果品种单一的局面，利用种内生物多样性控制病害[22,28]。

本研究利用形态学观察与分子方法鉴定百香果茎基腐病菌，确定分离所得病原菌为腐皮镰刀菌(F.solani)；并对不同病原菌菌株的致病力进行了测试筛选，在此基础上，利用不同药剂进行处理，研究其对病原菌的生长及致病力的影响。本研究较为科学、全面地了解了广东省百香果产区茎基腐病的致病菌情况，且筛选了效果较佳的防治药剂，有效防止茎基腐病情蔓延传播。不足之处在于，试验中致病菌均采集于广东省百香果主产区，其他产区如广西、福建、云南等地的百香果菌株未涉及，所以数据结果未必适用于国内其他产区，在进一步研究中，将扩大样品采集范围，开展百香果茎基腐病病理学及综合防控等相关研究，为解决百香果产业的关键技术难题提供基础。